microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2019-2-62-68microbe-1150Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВыявление механизмов изменения продукции ацетоина у генетически измененных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль ТорIdentification of the Mechanisms of Acetoin Production Change in Genetically Altered Vibrio cholerae Strains O1 Biovar El TorЗадноваС. П.ZadnovaS. P.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruКрицкийА. А.KritskyA. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ПлехановН. А.PlekhanovN. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ГусеваН. П.GusevaN. P.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ЛозовскийЮ. В.LozovskyYu. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

СмирноваН. И.SmirnovaN. I.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe” of the RospotrebnadzorRussian Federation201902072019026268Copyright © Заднова С.П., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Гусева Н.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И., 20192019Заднова С.П., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Гусева Н.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И.Zadnova S.P., Kritsky A.A., Plekhanov N.A., Guseva N.P., Lozovsky Y.V., Smirnova N.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1150

Цель работы – установление механизмов изменения биосинтеза ацетоина в реакции Фогес-Проскауэра у генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использовали девять генетически измененных штаммов V. cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара, завезенных на территорию Российской Федерации и Украины в 1993–2011 гг., и четыре типичных штамма, изолированных в 1970–1972 гг. В качестве отрицательного контроля при изучении продукции ацетоина штаммами V. cholerae в реакции Фогес-Проскауэра использовали штамм V. cholerae 569В О1 серогруппы классического биовара. Относительную экспрессию генов изучали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Построение модели белка проводили с использованием автоматизированного сервера SWISS – MODEL.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Показано, что диагностически значимый признак – реакция Фогес-Проскауэра, используемая для дифференциации биоваров V. cholerae O1, изменен у всех изученных генетически измененных штаммов возбудителя холеры, выделенных в разные периоды текущей седьмой пандемии (66,7 % штаммов дают слабоположительную реакцию, 33,3 % – отрицательную). Полученные данные указывают на снижение или отсутствие продукции ацетоина у изученных штаммов. Анализ четырех структурных генов als оперона, а также исследование экспрессии регуляторных генов alsR и аphA, контролирующих его биосинтез, выявил, что изменение продукции ацетоина у геновариантов является следствием делеции единичного нуклеотида (Т в позиции 315) в структурном гене alsD, кодирующем ацетолактат декарбоксилазу, а также высокого уровня экспрессии негативного регулятора биосинтеза ацетоина – гена aphA. Моделирование пространственной структуры белка AlsD геноварианта М1293 и референс-штамма N16961 показало, что белок AlsD геноварианта действительно сильно редуцирован. Однако в отсутствие ацетолактат декарбоксилазы возможно спонтанное декарбоксилирование, что фенотипически проявляется в наличии слабоположительной реакции Фогес-Проскауэра. 

Objective of the study was to determine the mechanisms of acetoin biosynthesis change in genetically altered El Tor V. cholerae strains in Voges-Proskauer test.

Materials and methods

Materials and methods. We used nine genetically altered V. cholerae O1 strains, biovar El Tor, imported in the territory of the Russian Federation and Ukraine between 1993–2011, and four typical strains isolated in 1970–1972. When assessing acetoin production in V. cholerae strains in Voges-Proskauer test, the strain V. cholerae 569B O1 serogroup, classical biovar served as negative control of the assay. Relative gene expression was studied using real-time RT-PCR. Protein model construction was performed by means of automated server SWISS – MODEL.

Results and discussion

Results and discussion. It has been demonstrated that diagnostically significant feature – VogesProskauer reaction, utilized for V. cholerae O1 biovar differentiation, is changed in all investigated genetically altered strains of cholera agent, isolated in different periods of the current seventh pandemic (66.7 % of the strains show weakly positive reaction, 33.3 % – negative one). The data obtained testify to the reduction or absence of acetoin production in the investigated strains. Analysis of four structural genes of als operon, as well as expression of regulatory genes alsR and аphA, responsible for acetoin biosynthesis, has revealed that changes in acetoin production in the genovariants stem from the deletion of a single nucleotide (T in the position 315) in the structural gene alsD, encoding acetolaktat decarboxylase, and also from high levels of negative acetoin biosynthesis regulator expression – аphA gene. Modeling of the spatial (3-D) structure of AlsD protein in the genovariant M1293 and the reference-strain N16961 has shown that AlsD protein of the genovariant is, indeed, considerably reduced. However, spontaneous decarboxylation is possible in the absence of acetolaktat decarboxylase, which phenotypically manifests itself in borderline positive Voges-Proskauer test. 

Vibrio cholerae О1 серогруппы биовара Эль Торреакция Фогес-Проскауэрабиосинтез ацетоинаструктура генов als оперонаэкспрессия регуляторных геновVibrio cholerae O1 serogroupbiovar El TorVoges-Proskauer testacetoin biosynthesisgene structure of als operonexpression of regulatory genesReferencesAli M., Nelson A. R., Lopez A.L., Sack D. A. Updated global burden of cholera in endemic countries. PLoS. Negl. Trop. Dis. 2015; 9(6):e0003832. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003832Ali M., Nelson A. R., Lopez A.L., Sack D. A. Updated global burden of cholera in endemic countries. PLoS. Negl. Trop. Dis. 2015; 9(6):e0003832. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003832World Health Organization. Cholera, 2017. Wkly. Epidemiol. Rec. 2018; 93(38):489–500.World Health Organization. Cholera, 2017. Wkly. Epidemiol. Rec. 2018; 93(38):489–500.Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48–89.Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48–89.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–99. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–99. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S., Ansaruzzaman M., Alam M., Hamabata T., Takeda Y., Sack D.A., Nair G.B. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 2006; 55(11):1563–69. DOI: 10.1099/jmm.0.46689-0.Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S., Ansaruzzaman M., Alam M., Hamabata T., Takeda Y., Sack D.A., Nair G.B. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 2006; 55(11):1563–69. DOI: 10.1099/jmm.0.46689-0.Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbilol. 2011; 49(11):3739– 49. DOI: 10.1128/JCM.01286-11.Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbilol. 2011; 49(11):3739– 49. DOI: 10.1128/JCM.01286-11.Brumfield K.D., Carignan B.M., Son M.S. Genotypic and phenotypic assays to distinguish Vibrio cholerae biotype. In: Sikora A., editor. Vibrio cholerae. Methods in Molecular Biology. Humana Press, New York, NY; 2018. Vol. 1839. P. 11–28. DOI: 10.1007/9781-4939-8685-9_2.Brumfield K.D., Carignan B.M., Son M.S. Genotypic and phenotypic assays to distinguish Vibrio cholerae biotype. In: Sikora A., editor. Vibrio cholerae. Methods in Molecular Biology. Humana Press, New York, NY; 2018. Vol. 1839. P. 11–28. DOI: 10.1007/9781-4939-8685-9_2.Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420–433. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x.Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420–433. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 480 с.Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. M.: “Mir”; 1984. 480 p.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2–ΔΔCt method. Methods. 2001; 25:402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2–ΔΔCt method. Methods. 2001; 25:402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.Benkert P., Biasini M., Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics. 2011; 27:343−50. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq662.Benkert P., Biasini M., Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics. 2011; 27:343−50. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq662.Bertoni M., Kiefer F., Biasini M., Bordoli L., Schwede T. Modeling protein quaternary structure of homoand hetero-oligomers beyond binary interactions by homology. Sci. Rep. 2017; 7:10480. DOI: 10.1038/s41598-017-09654-8.Bertoni M., Kiefer F., Biasini M., Bordoli L., Schwede T. Modeling protein quaternary structure of homoand hetero-oligomers beyond binary interactions by homology. Sci. Rep. 2017; 7:10480. DOI: 10.1038/s41598-017-09654-8.Смирнова Н.И., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2011; 3:3–10.Smirnova N.I., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. Genetic characteristics of clinical Vibrio cholerae strains, imported in the territory of the Russian Federation in the modern period. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology, and Immunobiology]. 2011; 3:3–10.Савельев В.Н., Савельева И.В., Бабенышев Б.В., Куличенко А.Н. Эволюция возбудителя и клиникоэпидемиологические особенности современной холеры ЭльТор. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012; 5:31–5.Savel’ev V.N., Savel’eva I.V., Babenyshev B.V., Kulichenko A.N. Evolution of the agent and clinical-epidemiological peculiarities of modern-day cholera El Tor. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2012; 5:31–5.Плеханов Н.А., Заднова С.П. Структурно-функцио¬ нальный анализ генов, кодирующих биосинтез маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии у различных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 4:75–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-75-78.Plekhanov N.A., Zadnova S.P. Structural-Functional Analysis of the Genes, Encoding Biosynthesis of Mannose-Sensitive Hemagglutinating Pili of Adhesion in Different Vibrio cholerae El Tor Strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 4:75–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-75-78.Монахова Е.В., Писанов Р.В., Титова С.В. Особенности структуры генома возбудителей холеры, циркулирующих на территориях России и сопредельных стран. В кн.: Покровский В.И., редактор. Сборник трудов IХ Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Тамбов: ООО фирма «Юлис», 2017. Т. 1. С. 325–7.Monakhova E.V., Pisanov R.V., Titova S.V. [Peculiarities of genome structure in cholera agents, circulating in the territories of Russia and other neighboring countries]. In.: Pokrovsky V.I., editor. [Proceedings of the IX All-Russian Scientific-andPractical Conference with International Participation “Molecular Diagnostics”]. Tambov: «Ulyss» Ltd.; 2017. Vol. 1. P. 325–7.Kuleshov K.V., Kostikova A., Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Tikhonov S.N., Savelievа I.V., Saveliev V.N., Vasilieva O.V., Zinich L.S., Pidchenko N.N., Kulichenko A.N., Shipulin G.A. Comparative genomic analysis of two isolates of Vibrio cholerae O1 Ogawa El Tor isolated during outbreak in Mariupol in 2011. Infect. Genet. Evol. 2016; 44:471–8. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.07.039.Kuleshov K.V., Kostikova A., Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Tikhonov S.N., Savelievа I.V., Saveliev V.N., Vasilieva O.V., Zinich L.S., Pidchenko N.N., Kulichenko A.N., Shipulin G.A. Comparative genomic analysis of two isolates of Vibrio cholerae O1 Ogawa El Tor isolated during outbreak in Mariupol in 2011. Infect. Genet. Evol. 2016; 44:471–8. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.07.039.Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(2):64–9. DOI: 10.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritsky A.A., Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. Comparative analysis of glucose metabolism in Vibrio cholerae strains, biovar El Tor. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya, Virusologiya [Molecular genetics, Microbiology, and Virology]. 2017; 35(2):64–9. DOI: 10.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., Okamoto K., Ghosh A., Ramamurthy T., Mukhopadhyay A.K. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; 10:111. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00111.Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., Okamoto K., Ghosh A., Ramamurthy T., Mukhopadhyay A.K. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; 10:111. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00111.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.