microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2019-2-87-92microbe-1154Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРекомбинантный штамм Escherichia coli с повышенной продукцией нейраминидазы Vibrio choleraeRecombinant Escherichia coli Strain with Enhanced Production of Vibrio cholerae NeuraminidaseМонаховаЕ. В.MonakhovaE. V.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002

monakhova_ev@antiplague.ruДемидоваГ. В.DemidovaG. V.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002

plague@aaanet.ruПисановР. В.PisanovR. V.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002

plague@aaanet.ruДувановаО. В.DuvanovaO. V.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002

plague@aaanet.ruМишанькинБ. Н.Mishan’kinB. N.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002

plague@aaanet.ruФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»РоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian Federation201903072019028792Copyright © Монахова Е.В., Демидова Г.В., Писанов Р.В., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., 20192019Монахова Е.В., Демидова Г.В., Писанов Р.В., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н.Monakhova E.V., Demidova G.V., Pisanov R.V., Duvanova O.V., Mishan’kin B.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1154

Целью работы явилось клонирование гена nanH Vibrio cholerae в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем т5-промотора, и создание штамма E. coli – продуцента рекомбинантной нейраминидазы.

Материалы и методы. Донором ДНК послужил штамм V. cholerae о1, векторной плазмидой – pQE30. Ген амплифицировали с помощью пцр, клонирование осуществляли общепринятыми методами, продуктивность рекомбинантов и локализацию искомого белка определяли по результатам электрофореза лизатов клеток. Нейраминидазную активность определяли по наличию флуоресценции в ультрафиолетовом свете после инкубации со специфическим субстратом (4-метилумбеллиферил-N-ацетилнейраминовой кислотой). результаты и обсуждение. Сконструирована рекомбинантная плазмида pNanH, содержащая ген nanH V. cholerae, встроенный по сайтам BamHI-PstI в полилинкер pQE30. Экспрессия клонированного гена в штамме-продуценте E. Сoli JM103pNanH происходит под контролем т5-промотора при индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (иптг). Штамм обладает нейраминидазной активностью. рекомбинантный белок NanH накапливается в клетках продуцента в двух формах. первая, с молекулярной массой (мм) 89,5 кда, представляет собой непроцессированный белок с гексагистидиновым блоком (6His-tag) на N-конце и находится в тельцах включения. Ее содержание составляет 5,6–6,6 % суммарных клеточных белков. вторая, с мм 83 кда, обнаруживается в периплазматическом пространстве клеток и соответствует зрелой NanH, содержание составляет 3,4–3,8 %. Их общее содержание – 9–10 % суммарных клеточных белков, что позволяет считать штамм E. coli JM103pNanH суперпродуцентом искомого фактора. Штамм может быть использован для получения NanH V. cholerae в целях создания специфических диагностических, терапевтических и фармацевтических препаратов, а также для изучения свойств этого белка как фактора патогенности/персистенции возбудителя. 

Objective of this work was cloning of the Vibrio cholerae nanH gene as part of a plasmid vector, providing expression of foreign genes under the control of T5 promoter, and construction of a E. coli strain – producer of V. cholerae recombinant neuraminidase.

Materials and methods

Materials and methods. V. cholerae о1 strain served as a DNA donor, pQE30 – as a vector plasmid. The gene was PCR-amplifi ed, the cloning was carried out by means of conventional methods, performance of recombinants and localization of the required protein was determined based on the results of electrophoresis of cell lysates. Neuraminidase activity was identifi ed by fl uorescence in ultraviolet light after incubation with specifi c substrate (4-methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic acid).

Results and discussion

Results and discussion. Recombinant plasmid pNanH, containing the cloned gene nanH V. cholerae, has been constructed. The gene is inserted into BamHI-PstI sites of the polylinker of pQE30. Expression of the cloned gene in the producer strain E. coli JM103pNanH occurs under the control of T5 promoter after isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) induction. The strain shows neuraminidase activity. The recombinant NanH protein is accumulated in the producer’s cells in two forms. The fi rst form, with molecular mass (MM) of 89.5 kDa, is an unprocessed protein with the hexahistidine block (6His-tag) at its N-terminus, it is located in inclusion bodies. Its percentage is 5.6–6.6 % of the total cell proteins. The second one, with MM of 83 kDa, is found in the periplasmic space and corresponds to the mature NanH, its percentage being 3.4–3.8 %. The total percentage of both forms is 9–10 % of total cell proteins, which allows to consider the strain E. coli JM103pNanH to be a super-producer of the required protein. The strain may be used for purifi cation of NanH preparations for construction of specifi c diagnostic, therapeutic and pharmaceutical preparations as well as for investigation of the protein as a virulence/persistence factor of the pathogen. 

нейраминидаза Vibrio choleraeрекомбинантная плазмидаклонирование генаэкспрессия в Escherichia coliVibrio cholerae neuraminidasegene cloningrecombinant plasmidexpression in Escherichia coliReferencesGalen J.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.N., Wasserman S.S., Kaper J.B. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin. Infect. Immun. 1992; 60(2):406–15. PMID: 1730470. PMCID: PMC257643.Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.N., Wasserman S.S., Kaper J.B. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin. Infect. Immun. 1992; 60(2):406–15. PMID: 1730470. PMCID: PMC257643.Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002; 148(Pt 11):3681–93. DOI: 10.1099/00221287-148-11-3681.Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002; 148(Pt 11):3681–93. DOI: 10.1099/00221287-148-11-3681.Figueiredo S.C., Neves-Borges A.C., Coelho A. The neuraminidase gene is present in the non-toxigenic Vibrio chol- erae Amazonia strain: a different allele in comparison to the pan- demic strains. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005; 100(6):563–9. DOI: 10.1590/S0074-02762005000600010.Figueiredo S.C., Neves-Borges A.C., Coelho A. The neuraminidase gene is present in the non-toxigenic Vibrio chol- erae Amazonia strain: a different allele in comparison to the pan- demic strains. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005; 100(6):563–9. DOI: 10.1590/S0074-02762005000600010.Eneva R.T., Engibarov S.A., Petrova P., Abrashev R., Strateva T., Kolyovska V., Abrashev J. High production of neuraminidase by a Vibrio cholerae non-O1 strain – the first possible alternative to toxi- genic producers. Appl. Biochem. Biotechnol. 2015; 176(2):412–27. DOI: 10.1007/s12010-015-1584-4.Eneva R.T., Engibarov S.A., Petrova P., Abrashev R., Strateva T., Kolyovska V., Abrashev J. High production of neuraminidase by a Vibrio cholerae non-O1 strain – the first possible alternative to toxi- genic producers. Appl. Biochem. Biotechnol. 2015; 176(2):412–27. DOI: 10.1007/s12010-015-1584-4.Diesner S.C., Bergmayr C., Wang X.Y., Heiden D., Exenberger S. Roth-Walter F., Starkl P., Ret D., Palischoll J., Gabor F., Untersmayr E. Characterisation of Vibrio cholerae neuramini- dase as an immunomodulator for novel formulation of oral allergy immunotherapy. Clin. Immunol. 2018; 192:30–9. DOI: 10.1016/j.clim.2018.03.017.Diesner S.C., Bergmayr C., Wang X.Y., Heiden D., Exenberger S. Roth-Walter F., Starkl P., Ret D., Palischoll J., Gabor F., Untersmayr E. Characterisation of Vibrio cholerae neuramini- dase as an immunomodulator for novel formulation of oral allergy immunotherapy. Clin. Immunol. 2018; 192:30–9. DOI: 10.1016/j.clim.2018.03.017.Mountney A., Zahner M.R., Lorenzini I., Oudega M., Schramm L.P., Schnaar R.L. Sialidase enhances recovery from spinal cord contusion injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(25):11561–6. DOI: 10.1073/pnas.1006683107.Mountney A., Zahner M.R., Lorenzini I., Oudega M., Schramm L.P., Schnaar R.L. Sialidase enhances recovery from spinal cord contusion injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(25):11561–6. DOI: 10.1073/pnas.1006683107.Mountney A., Zahner M.R., Sturgill E.R., Riley C.J., Aston J.W., Oudega M., Schramm L.P., Hurtado A., Schnaar R.L. Sialidase, chondroitinase ABC, and combination therapy after spinal cord con- tusion injury. J. Neurotrauma. 2013; 30(3):181–90. DOI: 10.1089/neu.2012.2353.Mountney A., Zahner M.R., Sturgill E.R., Riley C.J., Aston J.W., Oudega M., Schramm L.P., Hurtado A., Schnaar R.L. Sialidase, chondroitinase ABC, and combination therapy after spinal cord con- tusion injury. J. Neurotrauma. 2013; 30(3):181–90. DOI: 10.1089/neu.2012.2353.Taylor G., Vimr E., Garman E., Laver G. Purification, crys- tallization and preliminary crystallografic study of neuraminidase from Vibrio cholerae and Salmonella typhimurium LT2. J. Mol. Biol. 1992; 226(4):1287–90. PMID: 1518058.Taylor G., Vimr E., Garman E., Laver G. Purification, crys- tallization and preliminary crystallografic study of neuraminidase from Vibrio cholerae and Salmonella typhimurium LT2. J. Mol. Biol. 1992; 226(4):1287–90. PMID: 1518058.МишанькинБ.Н., ШиманюкН.Я., РябухинаО.Ю., Власов В.П. Штамм E. coli HB101 pRD39 – продуцент нейраминидазы холерного вибриона. Авторское свидетельство № 1210278 от 08.10.1985 г., опубл. 23.02.1987, Бюл. № 7.Mishan’kin B.N., Shimanyuk N.Ya., Ryabukhina O.Yu., Vlasov V.P. Shtamm E. coli HB101 pRD39 – producent neiramin- idazy cholernogo vibriona. [Certificate of authorship № 1210278], 08.10.1985, published 23.02.1987, Bul. No.7.Vimr E.R., Lawrisuk L., Galen J., Kaper J.B. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nanH in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1988; 170(4):1495–504.Vimr E.R., Lawrisuk L., Galen J., Kaper J.B. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nanH in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1988; 170(4):1495–504.Moustafa I., Connaris H., Taylor M., Zaitsev V., Wilson J.C., Kiefel M.J., von Itzstein M., Taylor G. Sialic acid recognition by Vibrio cholerae neuraminidase. J. Biol. Chem. 2004; 279(39):40819– 26. DOI: 10.1074/jbc.M404965200.Moustafa I., Connaris H., Taylor M., Zaitsev V., Wilson J.C., Kiefel M.J., von Itzstein M., Taylor G. Sialic acid recognition by Vibrio cholerae neuraminidase. J. Biol. Chem. 2004; 279(39):40819– 26. DOI: 10.1074/jbc.M404965200.Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А., Михась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli. Биотехнология. 2006; 6:8–15.Monakhova E.V., Pisanov R.V., Goncharova L.A., Cloning and expression of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease gene (hapA) in Escherichia coli. Biotechnology in Russia. 2006; (6):8–15.Рябухина О.Ю., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Определение нейраминидазы у вибрионов О1 и не О1 групп. Лабораторное дело. 1990; (8):63–5.Ryabukhina O.Yu., Shimanyuk N.Ya., Mishan’kin B.N. Detection of neurominidase in vibrios of О1and non-О1 groups. Laboratornoe delo [Laboratory Science] 1990; (8):63–5.Монахова Е.В., Писанов Р.В, Демидова Г.В., Непомнящая Н.Б. Штамм Escherichia coli – суперпродуцент ге- молизина Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 1:90–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93.Monakhova E.V., Pisanov R.V., Demidova G.V., Nepomnyashchaya N.B. Escherichia coli strain – super-producer of Vibrio cholerae hemolysin. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; (1):90–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.