microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2019-3-43-50microbe-1175Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESНовые генетические маркеры для молекулярного типирования штаммов Bacillus anthracisNew Genetic Markers for Molecular Typing of Bacillus anthracis StrainsЕременкоЕ. И.EremenkoE. I.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruРязановаА. Г.RyazanovaA. G.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruПисаренкоС. В.PisarenkoS. V.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruБуравцеваН. П.BuravtsevaN. P.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruПечковскийГ. А.PechkovskyG. A.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruАксеноваЛ. Ю.AksenovaL. Yu.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruСеменоваО. В.SemenovaO. V.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruВарфоломееваН. Г.VarfolomeevaN. G.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruГоловинскаяТ. М.GolovinskayaT. M.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruЧмеренкоД. К.ChmerenkoD. K.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruКовалевД. А.KovalevD. A.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruЖировА. М.ZhirovA. M.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruШапаковН. А.ShapakovN. A.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruКуличенкоА. Н.KulichenkoA. N.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035.

stavnipchi@mail.ruСтавропольский научно-исследовательский противочумный институтРоссияStavropol Research Anti-Plague InstituteRussian Federation201913102019034350Copyright © Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Писаренко С.В., Буравцева Н.П., Печковский Г.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Варфоломеева Н.Г., Головинская Т.М., Чмеренко Д.К., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Шапаков Н.А., Куличенко А.Н., 20192019Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Писаренко С.В., Буравцева Н.П., Печковский Г.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Варфоломеева Н.Г., Головинская Т.М., Чмеренко Д.К., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Шапаков Н.А., Куличенко А.Н.Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Pisarenko S.V., Buravtseva N.P., Pechkovsky G.A., Aksenova L.Y., Semenova O.V., Varfolomeeva N.G., Golovinskaya T.M., Chmerenko D.K., Kovalev D.A., Zhirov A.M., Shapakov N.A., Kulichenko A.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1175

Цель - выявление новых генетических маркеров для использования в молекулярном типировании Bacillus anthracis. Материалы и методы. исследовали геномы 16 штаммов B. anthracis из коллекции ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт», 11 штаммов B. anthracis и 5 штаммов Bacillus cereus из GenBank. использовали методы анализа in vitro и in silico канонических и полногеномных единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR). Результаты и обсуждение. У ряда штаммов B. anthracis главной генетической линии B в пределах гомологичных генов трицистронного оперона gerH, кодирующего белки, связанные прорастанием спор, имеются делеции и (или) замены единичных нуклеотидов. гены gerA оперона содержат VNTR-локус Bams34, размеры генов у разных штаммов варьируют из-за разного числа тандемных повторов и наличия инделов, что предполагает вариабельность белков GerA прорастания спор. в области отжига обратного праймера у части из них имеются SNP или делеция, что делает невозможной пцр-амплификацию локуса Bams34. идентифицированы не описанные VNTR-локус, SNP и индел в последовательностях плазмид pXO1 и pXO2, а также SNP в хромосомном гене транспортера глицерол-3-фосфата. сконструированы две пары пцр-праймеров к плазмидным областям, содержащим инделы. VNTR-локус, SNP и инделы в последовательностях плазмид pXO1 и pXO2 пригодны в качестве генетических маркеров для дифференциации типичных вирулентных диплазмидных штаммов по принадлежности к основным генетическим линиям B. anthracis A, B и C. Аллель T SNP в пределах хромосомного гена glpT является специфичной для одного из двух штаммов, выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы, и отличает его от всех других штаммов B. anthracis.

Objective: Identification of new markers for the molecular typing of Bacillus anthracis. Materials and methods. The genomes of 16 B. anthracis strains from the collection of the Stavropol Research Anti-Plague Institute, 11 B. anthracis strains and 5 strains of Bacillus cereus from GenBank were investigated. The methods of in vitro and in silico analysis of canonical and whole-genome single nucleotide polymorphisms (SNP), genome regions with variable number of tandem repeats (VNTR) were used for the analysis. Results and discussion. It has been established that there are deletions and (or) SNPs in some of B. anthracis strains of the main genetic lineage B, within the homologous genes of the tri-cistronic operon gerH, which encodes spore germination proteins. gerA genes contain the Bams34 VNTR locus, the sizes of genes in different strains vary due to the different number of tandem repeats and the presence of indels, which suggests the variability of GerA spore germination proteins. In the area of reverse primer annealing, some of them have several SNPs or deletions, which makes impossible PCR amplification of the Bams34 locus. Previously not described VNTR locus, SNPs and indels in sequences of plasmids pXO1 and pXO2, as well as SNP in chromosomal gene of glycerol-3-phosphate transporter were identified. Two pairs of PCR primers for the variable regions of the plasmids were designed. VNTR-locus, SNP and indels in sequences of plasmids pXO1 and pXO2 are suitable genetic markers for the differentiation of typical virulent diplasmid strains belonging to the main genetic lineages of B. anthracis A, B and C. The allele T of SNP within chromosomal glpT gene is specific for one of two strains isolated during the outbreak of anthrax and distinguishes it from all other strains of B. anthracis.

Bacillus anthracisмолекулярное типированиеSNPVNTRинделыглавные генетические линииBacillus anthracismolecular typingSNPVNTRindelsmain genetic lineagesReferencesKeim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R., Jackson P.J., Hugh-Jones M.E. Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis Reveals Genetic Relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182(10):2928-36. DOI: 10.1128/jb.182.10.2928-2936.2000.Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R., Jackson P.J., Hugh-Jones M.E. Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis Reveals Genetic Relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182(10):2928-36. DOI: 10.1128/jb.182.10.2928-2936.2000.Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J., Zanecki S.R., Pearson T., Simonson T.S, U’Ren J.M., Kachur S.M., Leadem-Dougherty R.R., Rhoton S.D., Zinser G., Farlow J., Coker P.R., Smith K.L., Wang B., Kenefic L.J., Fraser-Liggett C.M., Wagner D.M., Keim P. Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007; 2(5):e461. DOI: 10.1371/journal.pone.0000461.Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y, Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J., Zanecki S.R., Pearson T., Simonson T.S, U’Ren J.M., Kachur S.M., Leadem-Dougherty R.R., Rhoton S.D., Zinser G., Farlow J., Coker P.R., Smith K.L., Wang B., Kenefic L.J., Fraser-Liggett C.M., Wagner D.M., Keim P. Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007; 2(5):e461. DOI: 10.1371/journal.pone.0000461.Gierczynski R., Jakubczak A., Jagielski M. Extended Multiple-Locus Variable Tandem-Repeat Analysis of Bacillus an¬thracis Strains Isolated in Poland. Pol. J. Microbiol. 2009; 58(1):3—7. PMID: 19469279.Gierczynski R., Jakubczak A., Jagielski M. Extended Multiple-Locus Variable Tandem-Repeat Analysis of Bacillus an¬thracis Strains Isolated in Poland. Pol. J. Microbiol. 2009; 58(1):3-7. PMID: 19469279.Okutani A., Sekizuka T., Boldbaatar B., Yamada A., Kuroda M., Inoue S. Phylogenetic Typing of Bacillus anthracis Isolated in Japan by Multiple LocusVariable-Number Tandem Repeats and the Comprehensive Single Nucleotide Polymorphism. J. Vet. Med. Sci. 2010; 72(1):93-7. DOI: 10.1292/jvms.09-0213.Okutani A., Sekizuka T., Boldbaatar B., Yamada A., Kuroda M., Inoue S. Phylogenetic Typing of Bacillus anthracis Isolated in Japan by Multiple LocusVariable-Number Tandem Repeats and the Comprehensive Single Nucleotide Polymorphism. J. Vet. Med. Sci. 2010; 72(1):93-7. DOI: 10.1292/jvms.09-0213.Antwerpen M., Ilin D., Georgieva E., Meyer H., Savov E., Frangoulidis D. MLVA and SNP analysis identified a unique genetic cluster in Bulgarian Bacillus anthracis strains. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 30(7):923-30. DOI: 10.1007/s10096-011-1177-2.Antwerpen M., Ilin D., Georgieva E., Meyer H., Savov E., Frangoulidis D. MLVA and SNP analysis identified a unique genetic cluster in Bulgarian Bacillus anthracis strains. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 30(7):923-30. DOI: 10.1007/s10096-011-1177-2.Jung K.H., Kim S.H., Kim S.K., Cho S.Y., Chai J.C., Lee Y.S., Kim J.C., Kim S.J., Oh H.B., Chai Y.G. Genetic populations of Bacillus anthracis isolates from Korea. J. Vet. Sci. 2012; 13(4):385— 93. DOI: 10.4142/jvs.2012.13.4.385.Jung K.H., Kim S.H., Kim S.K., Cho S.Y, Chai J.C., Lee YS., Kim J.C., Kim S.J., Oh H.B., Chai YG. Genetic populations of Bacillus anthracis isolates from Korea. J. Vet. Sci. 2012; 13(4):385-93. DOI: 10.4142/jvs.2012.13.4.385.Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Tsygankova O.I., Tsygankova E.A., Buravtseva N.P., Kulitchenko A.N. Genotype Diversity of Bacillus anthracis Strains Isolated from the Caucasus Region. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2012; 27(2):74—8. DOI: 10.3103/S0891416812020024.Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Tsygankova O.I., Tsygankova E.A Buravtseva N.P., Kulitchenko A.N. Genotype Diversity of Bacillus anthracis Strains Isolated from the Caucasus Region. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2012; 27(2):74-8. DOI: 10.3103/S0891416812020024.Beyer W., Bellan S., Eberle G., Ganz H.H., Getz W.M., Haumacher R., Hilss K.A., Kilian W., Lazak J., Turner W. C., Turnbul P.C.B. Distribution and Molecular Evolution of Bacillus anthracis Genotypes in Namibia. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(3):e1534. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001534.Beyer W., Bellan S., Eberle G., Ganz H.H., Getz W.M., Haumacher R., Hilss K.A., Kilian W., Lazak J., Turner W.C., Turnbul P.C.B. Distribution and Molecular Evolution of Bacillus anthracis Genotypes in Namibia. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(3):e1534. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001534.Vergnaud G., Girault G., Thierry S., Pourcel C., Madam N., Blouin Y. Comparison of French and Worldwide Bacillus anthracis Strains Favors a Recent, Post-Columbian Origin of the Predominant North-American Clade. PLoS One. 2016; 11(2):e0146216. DOI: 10.1371/journal.pone.0146216.Vergnaud G., Girault G., Thierry S., Pourcel C., Madani N., Blouin Y Comparison of French and Worldwide Bacillus anthracis Strains Favors a Recent, Post-Columbian Origin of the Predominant North-American Clade. PLoS One. 2016; 11(2):e0146216. DOI: 10.1371/journal.pone.0146216.Derzelle S., Thierry S. Genetic Diversity of Bacillus anthracis in Europe: Genotyping Methods in Forensic and Epidemiologic Investigations. Biosecurity and Bioterrorism: Biodefense Strategy, Practice, and Science. 2013; 11(1):166-76. DOI: 10.1089/bsp.2013.0003.Derzelle S., Thierry S. Genetic Diversity ofBacillus anthracis in Europe: Genotyping Methods in Forensic and Epidemiologic Investigations. Biosecurity and Bioterrorism: Biodefense Strategy, Practice, and Science. 2013; 11(1):166-76. DOI: 10.1089/bsp.2013.0003.Aikembayev A. M., Lukhnova L., Temiraliyeva G., Meka-Mechenko T., Pazylov Y, Zakaryan S., Denissov G., Easterday W. R., Van Ert M. N.,Keim P, Francesconi S. C., Blackburn J. K., Hugh-Jones M., Hadfield T. Historical Distribution and Molecular Diversity of Bacillus anthracis, Kazakhstan. Emerg. Infect. Dis. 2010; 16(5):789-96. DOI: 10.3201/eid1605.091427.Aikembayev A. M., Lukhnova L., Temiraliyeva G., Meka-Mechenko T., Pazylov Y, Zakaryan S., Denissov G., Easterday W. R., Van Ert M. N.,Keim P., Francesconi S. C., Blackburn J. K., Hugh-Jones M., Hadfield T. Historical Distribution and Molecular Diversity of Bacillus anthracis, Kazakhstan. Emerg. Infect. Dis. 2010; 16(5):789-96. DOI: 10.3201/eid1605.091427.Durmaz R., Doganay M., Sahin M., Percin D., Karahocagil M.K., Kayabas U., Otlu B., Karagoz A., Buyuk F., Celebi O., Ozturk Z., Ertek M. Anthrax Study Group. Molecular epidemiology of the Bacillus anthracis isolates collected throughout Turkey from 1983 to 2011. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2012; 31(10):2783—90. DOI: 10.1007/s10096-012-1628-4.Durmaz R., Doganay M., Sahin M., Percin D., Karahocagil M.K., Kayabas U., Otlu B., Karagoz A., Buyuk F., Celebi O., Ozturk Z., Ertek M. Anthrax Study Group. Molecular epidemiology of the Bacillus anthracis isolates collected throughout Turkey from 1983 to 2011. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2012; 31(10):2783—90. DOI: 10.1007/s10096-012-1628-4.Okutani A., Tungalag H., Boldbaatar B., Yamada A., Tserennorov D., Otgonchimeg I., Erdenebat A., Otgonbaatar D., Inoue S. Molecular Epidemiological Study of Bacillus anthracis Isolated in Mongolia by Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for 8 Loci (MLVA-8). Jpn J. Infect. Dis. 2011; 64:345—8. PMID: 21788715.Okutani A., Tungalag H., Boldbaatar B., Yamada A., Tserennorov D., Otgonchimeg I., Erdenebat A., Otgonbaatar D., Inoue S. Molecular Epidemiological Study of Bacillus anthracis Isolated in Mongolia by Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for 8 Loci (MLVA-8). Jpn J. Infect. Dis. 2011; 64:345-8. PMID: 21788715.Еременко Е.И., Писаренко С.В., Аксенова Л.Ю., Рязанова А.Г., Жиров А.М., Семенова О.В., Бобрышева О.В., Ковалев Д.А., Куличенко А.Н. Филогенетика, эволюция и филогеография Bacillus anthracis. Бактериология. 2018; 3(2):57-63.Eremenko E.I., Pisarenko S.V., Aksenova L.Yu., Ryazanova A.G., Zhirov A.M., Semenova O.V., Bobrysheva O.V, Kovalev D.A., Kulichenko A.N. [Phylogeny, evolution, and phylogeography of Bacillus anthracis]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2018; 3(2):57-63.Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Иисаренко С.В., Варфоломеева Н.Е, Жиров А.М., Волынкина А.С., Буравцева Н.И., Головинская Т.М., Котенева Е.А., Цыганкова О.И., Дятлов И.А., Тимофеев В.С., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Кисличкина А.А., Миронова Р.И., Титарева ГМ., Скрябин Ю.И., Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Колбасов Д.В. Биологические свойства и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 1:94-9. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99.Kulichenko A.N., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Aksenova L. Yu., Kovalev D.A., Pisarenko S.V., Varfolomeeva N.G., Zhirov A.M., Volynkina АЯ., Buravtseva N.P., Golovinskaya T.M., Koteneva E.A., Tsygankova O.I., Dyatlov I.A., Timofeev V S., Bogun A.G., Bakhteeva I.V., Kislichkina A.A., Mironova R.I., Titareva G.M., Skryabin Yu. P., Selyaninov Yu. O., Egorova I. Yu., Kolbasov D.V. [Biological properties and molecular-genetic characteristics of Bacillus anthracis strains, isolated during the outbreak of anthrax in the Yamalo-Nenets Autonomous District in 2016]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 1:94-9. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99.Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115¬25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dis-semination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115¬25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Sahl J.W., Pearson T., Okinaka R., Schupp J.M., Gillece J.D., Heaton H., Birdsell D., Hepp C., Fofanov V, Noseda R., Fasanella A., Hoffmaster A., Wagner DM., Keim P. A Bacillus anthracis genome sequence from the Sverdlovsk 1979 autopsy specimens. mBio. 2016; 7(5):e01501-16. DOI: 10.1128/mBio.01501-16.Sahl J.W., Pearson T., Okinaka R., Schupp J.M., Gillece J.D., Heaton H., Birdsell D., Hepp C., Fofanov V., Noseda R., Fasanella A., Hoffmaster A., Wagner DM., Keim P. A Bacillus anthracis genome sequence from the Sverdlovsk 1979 autopsy specimens. mBio. 2016;7(5):e01501-16. DOI: 10.1128/mBio.01501-16.Van Ert M.N., Easterday W. R., Simonson T.S., U’Ren J.M., Pearson T., Kenefic L.J., Busch J.D., Huynh L.Y, Dukerich M., Trim C.B., Beaudry J., Welty-Bernard A., Read T., Fraser C.M., Ravel J., Keim P. Strain-Specific Single-Nucleotide Polymorphism Assays for the Bacillus anthracis Ames Strain. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(1):47-53. DOI: 10.1128/JCM.01233-06.Van Ert M.N., Easterday W. R., Simonson T.S., U’Ren J.M., Pearson T., Kenefic L.J., Busch J.D., Huynh L.Y, Dukerich M., Trim C.B., Beaudry J., Welty-Bernard A., Read T., Fraser C.M., Ravel J., Keim P. Strain-Specific Single-Nucleotide Polymorphism Assays for the Bacillus anthracis Ames Strain. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(1):47-53. DOI: 10.1128/JCM.01233-06.Beyer W., Bellan S., Eberle G., Ganz H.H., Getz W.M., Haumacher R., Hilss K.A., Kilian W., Lazak J., Turner W. C., Turnbull P.C. Distribution and Molecular Evolution of Bacillus anthracis Genotypes in Namibia. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(3):e1534. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001534.Beyer W., Bellan S., Eberle G., Ganz H.H., Getz W.M., Haumacher R., Hilss K.A., Kilian W., Lazak J., Turner W.C., Turnbull P.C. Distribution and Molecular Evolution of Bacillus anthracis Genotypes in Namibia. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(3):e1534. DOI: 10.1371/journaLpntd.0001534.Thierry S., Tourterel C., Le Fleche P., Derzelle S., Dekhil N., Mendy C., Colaneri C., Vergnaud G., Madani N. Genotyping of French Bacillus anthracis strains based on 31-loci multi locus VNTR analysis: epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database. PLoS One. 2014; 9(6):e95131. DOI: 10.1371/journal.pone.0095131.Thierry S., Tourterel C., Le Fleche P., Derzelle S., Dekhil N., Mendy C., Colaneri C., Vergnaud G., Madani N. Genotyping of French Bacillus anthracis strains based on 31-loci multi locus VNTR analysis: epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database. PLoS One. 2014; 9(6):e95131. DOI: 10.1371/journal.pone.0095131.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.