microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2019-3-106-110microbe-1176Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИспользование реакции латекс-агглютинации в ускоренном определении патогенных буркхольдерийApplication of Latex-Agglutination for Rapid Detection of Pathogenic BurkholderiaФроловД. М.FrolovD. M.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131.

vari2@sprint-v.com.ruСенинаТ. В.SeninaT. V.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131.

vari2@sprint-v.com.ruЗамаринаТ. В.ZamarinaT. V.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131.

vari2@sprint-v.com.ruХраповаН. П.KhrapovaN. P.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131.

vari2@sprint-v.com.ruВолгоградский научно-исследовательский противочумный институтРоссияVolgograd Anti-Plague Research InstituteRussian Federation20191310201903106110Copyright © Фролов Д.М., Сенина Т.В., Замарина Т.В., Храпова Н.П., 20192019Фролов Д.М., Сенина Т.В., Замарина Т.В., Храпова Н.П.Frolov D.M., Senina T.V., Zamarina T.V., Khrapova N.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1176

Цель. Разработка препарата для идентификации Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei, выращенных на плотной питательной среде, на этапе экспресс-диагностики патогенных булькхольдерий. Материалы и методы. За основу взят метод латекс-агглютинации, в котором в качестве носителя агглютининов применяют взвеси полимеров. Агент, распознающий антиген клеток-мишеней, представлял собой моноклональные антитела, направленные к эпитопам гликопротеина капсулы возбудителя мелиоидоза. жидкий латексный диагностикум готовили из взвеси полимерного полистирола с диаметром микросфер 0,8-1,1 мкм, поверхность которого нагружали предварительно подобранной концентрацией антител. В работе использовали типичные штаммы возбудителей мелиоидоза и сапа с полноценной антигенной структурой, а также близкородственные и гетерологичные микроорганизмы. Из бактериальных культур готовили взвеси с концентрацией 1,0·109 м.к./мл. Реакцию проводили на подогретых до 37 °С стеклянных чашках Петри с визуальной регистрацией результатов по 4-крестовой системе. Результаты и обсуждение. Реакция латекс-агглютинации основана на агглютинации микробных клеток (B. pseudomallei и B. mallei) моноклональными антителами, узнающими эпитопы гликопротеина капсулы патогенных буркхольдерий. проверено 14 моноклональных антител различных по классу и эпитопной направленности. определяющими факторами для выбора антитела являлись специфичность их в реакции агглютинации со штаммы возбудителей мелиоидоза и сапа, а также сохранение агглютинирующей активности после иммобилизации на полимерном носителе. в итоге, в качестве агента, распознающего антиген клеток-мишеней, выбрали моноклональные антитела иммуноглобулина класса G к эпитопам гликопротеина капсулы (АГ 8) возбудителя мелиоидоза. в результате после смешивания проб с диагностикумом в образцах, содержащих бактерии B. pseudomallei и B. mallei, через 10-15 мин образовывался агглютинат, видимый невооруженным глазом. Пробы с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами агглютината не имели и регистрировались как отрицательные. Полученный диагностикум характеризуется высокой специфичностью.

The aim. Development of a drug for the identification of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei grown in solid nutrient medium at the stage of rapid diagnosis of pathogenic bulkholderia. Materials and methods. Latex agglutination method, in which suspensions of polymers are used as a carrier of agglutinins. The agent recognizing the antigen of the target cells is a monoclonal antibody directed to the epitopes of the glycoprotein capsule of melioidosis causative agent. A liquid latex diagnosticum was prepared from a suspension of polymer polystyrene with a microsphere diameter of 0.8-1.1 pm, the surface of which was loaded with a pre-selected concentration of antibodies. We used typical strains of melioidosis and glanders agents with a full antigenic structure, as well as closely related and heterologous microorganisms. Suspensions with a concentration of 1.0·109 m.c./ml were prepared from bacterial cultures. The reaction was carried out on glass Petri dishes heated to 37 °C with visual recording of the results using four cross system. Results and discussion. The latex agglutination reaction is based on agglutination of microbial cells (B. pseudomallei and B. mallei) with monoclonal antibodies that recognize the epitopes of the glycoprotein capsule of pathogenic burkholderia. 14 monoclonal antibodies of different class and epitope orientation were checked. The determining factors for antibody selection was their specificity in agglutination reaction with strains of melioidosis and glanders agents, as well as preservation of agglutinating activity after immobilization on a polymer carrier. As a result, monoclonal antibodies of class G immunoglobulin to capsule glycoprotein epitopes (AG 8) of the melioidosis agent were selected as an agent recognizing the target cell antigen. As a result, after mixing the samples with the diagnosticum, in samples containing B. pseudomallei and B. mallei bacteria, visible agglutinate generates in 10-15 min. Samples with closely related and heterologous microorganisms lacked agglutinate and were registered as negative. The obtained diagnosticum is characterized by high specificity.

моноклональные антитела (МКА)латексные микрочастицыпатогенные буркхольдерииреакция латекс-агглютинации (РЛА)чувствительностьспецифичностьmonoclonal antibodies (MAbs)latex microparticlesBurkholderialatex agglutination testsensitivityspecificityReferencesGilad J., Schwartz D., Amsalem Y Clinical features and laboratory diagnosis of infection with the potential bioterrorism agents Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Int. J. of Biomed. Sci. 2007; 3:144-52. PMID: 23675037. PMCID: PMC3614684.Gilad J., Schwartz D., Amsalem Y. Clinical features and laboratory diagnosis of infection with the potential bioterrorism agents Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Int. J. of Biomed. Sci. 2007; 3:144-52. PMID: 23675037. PMCID: PMC3614684.Van Zandt K.E., Greer M.T., Gelhaus H.C. Glanders: an overview of infection in humans. Orphanet. J. RareDis. 2013; 8:131. DOI: 10.1186/1750-1172-8-131.Van Zandt K.E., Greer M.T., Gelhaus H.C. Glanders: an overview of infection in humans. Orphanet. J. Rare Dis. 2013; 8:131. DOI: 10.1186/1750-1172-8-131.Dance D. Treatment and prophylaxis of melioidosis. Int. J. Antimicrob. Agents. 2014; 43(4):310-18. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2014.01.005.Dance D. Treatment and prophylaxis of melioidosis. Int. J. Antimicrob. Agents. 2014; 43(4):310-18. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2014.01.005.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. Laboratory diagnostics of dangerous infectious diseases. Practical guide. M.: “Shiko”; 2013. 560 с.Hoffmaster A.R., AuCoin D., Baccam P., Baggett H.C. Baird R., Bhengsri S., Blaney D.D., Brett P.J., Brooks T.J., Brown K.A., Chantratita N., Cheng A.C., Dance D.A., Decuypere S., Defenbaugh D., Gee J.E., Houghton R., Jorakate P., Lertmemongkolchai G., Limmathurotsakul D., Merlin T.L, Mukhopadhyay C., Norton R., Peacock S.J., Rolim D.B., Simpson A.J., Steinmetz I., Stoddard R.A., Stokes M.M., Sue D., Tuanyok A., Whistler T., Wuthiekanun V, Walke H.T. Melioidosis diagnostic workshop, 2013. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(2). DOI: 10.3201/eid2102.141045.Hoffmaster A.R., AuCoin D., Baccam P, Baggett H.C. Baird R., Bhengsri S., Blaney D.D., Brett P.J., Brooks T.J., Brown K.A., Chantratita N., Cheng A.C., Dance D.A., Decuypere S., Defenbaugh D., Gee J.E., Houghton R., Jorakate P, Lertmemongkolchai G., Limmathurotsakul D., Merlin T.L, Mukhopadhyay C., Norton R., Peacock S.J., Rolim D.B., Simpson A.J., Steinmetz I., Stoddard R.A., Stokes M.M., Sue D., Tuanyok A., Whistler T., Wuthiekanun V, Walke H.T. Melioidosis diagnostic workshop, 2013. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(2). DOI: 10.3201/eid2102.141045.Zakharova I.B., Lopasteyskaya YA., Toporkov A.V., Viktorov D.V Influence of biochemical features of Burkholderia pseudomallei strains on identification reliability by Vitek 2 system. J. Glob. Infect. Dis. 2018; 10(1):7-10. DOI: 10.4103/jgid.jgid39_17.Zakharova I.B., Lopasteyskaya Y.A., Toporkov A.V., Viktorov D.V. Influence of biochemical features of Burkholderia pseudomallei strains on identification reliability by Vitek 2 system. J. Glob. Infect. Dis. 2018; 10(1):7-10. DOI: 10.4103/jgid.jgid39_17.Hantrakun V, Thaipadungpanit J RongkardP., Srilohasin P., Amornchai P., Langla S., Mukaka M., Chantratita N., Wuthiekanun V, Dance D.A.B., Day N.P.J., Peacock S.J., Limmathurotsakul D. Presence of B. thailandensis and B. thailandensis expressing B. pseudomallei-like capsular polysaccharide in Thailand, and their associations with serological response to B. pseudomallei. PLoS Negl. Trop Dis. 2018; 12(1):e0006193. DOI: 10.1371/journal.pntd.0006193.Hantrakun V., Thaipadungpanit J., RongkardP., Srilohasin P., Amornchai P., Langla S., Mukaka M., Chantratita N., Wuthiekanun V, Dance D.A.B., Day N.P.J., Peacock S.J., Limmathurotsakul D. Presence of B. thailandensis and B. thailandensis expressing B. pseudomallei-like capsular polysaccharide in Thailand, and their associations with serological response to B. pseudomallei. PLoS Negl. Trop Dis. 2018; 12(1):e0006193. DOI: 10.1371/journal.pntd.0006193.Peeters M., Chung P., Lin H., Mortelmans K., Phe C., San C., Kuijpers L.M.F., Teav S., Phe T., Jacobs J. Diagnostic accuracy of the InBiOS AMD rapid diagnostic test for the detection of Burkholderia pseudomallei antigen in grown blood culture broth. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2018; 37(6):1169-77. DOI: 10.1007/s10096-018-3237-3.Peeters M., Chung P., Lin H., Mortelmans K., Phe C., San C., Kuijpers L.M.F., Teav S., Phe T., Jacobs J. Diagnostic accuracy of the InBiOS AMD rapid diagnostic test for the detection of Burkholderia pseudomallei antigen in grown blood culture broth. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2018; 37(6):1169-77. DOI: 10.1007/s10096-018-3237-3.Бровкина А.Н. Разработка метода и тест-системы выявления бактерий рода Salmonella на основе латекс-агглютинации. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2011; 72:516-24.Brovkina A.N. Development of a method and test system for detecting bacteria of the genus Salmonella based on latex agglutination. [Polythematicl Internet electronic scientific journal of the Kuban State Agrarian University]. 2011; 72:516-24.Волина Е.Г., Слугин И.В., Верховский О.А., Яшина Н.В., Шкарлат П.Е., Прокопов Н.И., Грицкова И.А. Способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации. Патент РФ № 2177617, опубл. 27.12.2001.Volina E.G., Slugin I.V, Verkhovsky O.A., Yashina N.V., Shkarlat P.E., Prokopov N.I., Gritskova I.A. A method of preparing a leptospirosis diagnosticum for the formulation of the latex-agglutina-tion reaction. RFpatent No. 2177617, publ. 27.12.2001.Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка и испытания диагностикума на основе моноклональных антител для определения спор возбудителя сибирской язвы в реакции латекс-агглютинации. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 4(110):71-5. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-71-75.Khlyntseva A.E., Luneva N.M., Belova E.V., Dyatlov I.A Shemyakin I.G. Development and testing of a diagnosticum based on monoclonal antibodies to determine anthrax pathogen spores in latex agglutination reaction. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2011; 4(110):71-5. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-71-75.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.