microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2019-4-61-66microbe-1217Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПолучение штамма Yersinia pestis, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, и перспективы его использованияConstruction of Yersinia pestis Strain Producing Fluorescent Protein GFP and Prospects of Its UsageКуклеваЛ. М.KuklevaL. M.

Куклева Любовь Михайловна

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

Lubov M. Kukleva.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruТучковИ. В.TuchkovI. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruОглодинЕ. Г.OglodinE. G.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruДевдарианиЗ. Л.DevdarianiZ. L.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruМорозовО. А.MorozovO. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruКузнецовО. С.KuznetsovO. S.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruГерманчукВ. Г.GermanchukV. G.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruЕрошенкоГ. А.EroshenkoG. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005.

rusrapi@microbe.ruРоссийский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201918012020046166Copyright © Куклева Л.М., Тучков И.В., Оглодин Е.Г., Девдариани З.Л., Морозов О.А., Кузнецов О.С., Германчук В.Г., Ерошенко Г.А., 20202020Куклева Л.М., Тучков И.В., Оглодин Е.Г., Девдариани З.Л., Морозов О.А., Кузнецов О.С., Германчук В.Г., Ерошенко Г.А.Kukleva L.M., Tuchkov I.V., Oglodin E.G., Devdariani Z.L., Morozov O.A., Kuznetsov O.S., Germanchuk V.G., Eroshenko G.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1217

Цель работы - конструирование рекомбинантного штамма Y. pestis, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, и анализ перспектив его использования для изучения взаимодействия возбудителя с простейшими, а также с макроорганизмом млекопитающих (грызунов). Материалы и методы. Для создания штамма, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, использовали природный штамм Yersinia pestis, выделенный в 2016 г. в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы. ген флуоресцентного белка был введен в составе коммерческого вектора pTurboGFP-B методом электропорации. Свойства полученного рекомбинантного штамма Y. pestis 367 pTurbo-GFP-B исследовали с помощью микробиологических, биологических и молекулярно-генетических методов. Результаты и обсуждение. Методом электропорации получен штамм возбудителя чумы, содержащий векторную плазмиду pTurboGFP-B, которая кодирует синтез зеленого флуоресцирующего белка GFP, и имеющий устойчивость к антибиотику ампициллину. Сконструированный штамм Y. pestis, продуцирующий зеленый флуоресцентный белок, по своим культурально-морфологическим, биохимическим свойствам, вирулентности и выживаемости в смешанной культуре с акантамебами Acanthamoeba castellani не отличался от исходного. На плотных питательных средах рекомбинантный штамм и его субкультуры, полученные от зараженных животных, формировали колонии желто-зеленого цвета, флуоресцирующие при УФ-облучении. В препаратах, полученных от животных и из со-культур с амебами, наблюдали флуоресцирующие клетки возбудителя чумы. Созданный штамм можно использовать в качестве модельного для изучения в лабораторных условиях взаимоотношений возбудителя чумы с клетками простейших (почвенные амебы, нематоды) и млекопитающих.

Objective of the study was to construct the recombinant Y. pestis strain producing fluorescent protein GFP and analysis of the prospects of its usage for investigation of interaction of the agent with the protozoa, and also macroorganism of mammals (rodents). Materials and methods. To create the strain producing fluorescent protein GFP, we used the natural Y. pestis strain isolated in 2016 in Gorno-Altai high-mountain plague focus. Fluorescent protein gen was inserted into commercial vector pTurboGFP-B via electroporation. Properties of the obtained recombinant Y. pestis strain 367 pTurboGFP-B were studied using microbiological, biological, and molecular-genetic methods. Results and conclusions. The plague agent strain, containing vector plasmid pTurboGFP-B which encodes synthesis of green fluorescent protein GFP, and being resistant to ampicillin was constructed applying electroporation. The designed Y. pestis strain, producing green fluorescent protein, does not differ from the stock strain by its cultural-morphological, biochemical properties, virulence and survivability in mixed culture with Acanthamoeba castellani. On solid nutrient media, recombinant strain and its subcultures, obtained from infected animals, formed colonies of greenish-yellow color, becoming fluorescent under UV-light. In preparations from animals and from co-cultures with amoeba, fluorescent cells of plague agent were observed. The constructed strain can be utilized as a model one for investigation of interactions between plague agent and cells of protozoa (soil amoeba, nematodes) and mammals under laboratory conditions.

возбудитель чумырекомбинантный биофлуоресцентный штаммплазмида pTurboGFP-Bplague agentrecombinant bio-fluorescent strainplasmid pTurboGFP-B.ReferencesОнищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 191 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Natural Plague Foci in the Territory of Caucasus, Caspian-Sea Region, Central Asia and Siberia]. Moscow: “Meditsina”; 2005. 192 p.Солдаткин И.С., Руденчик Ю.В., Ефимов С.В. Эпизоотический процесс в природных очагах чумы (обзор данных и ревизия концепции). В кн.: Эйгелис Ю.К., редактор. вопросы паразитологии и неспецифической профилактики зоонозов. Саратов; 1988. С. 83-134.Soldatkin I.S., Rudenchik Yu.V., Efimov S.V. [Epizootic process in the natural foci of plague (the review of data and audit of the concept)]. In: [Issues of Parasitology and Non-Specific Prevention of zoonoses]. Saratov; 1988. P. 83-134.Попов Н.В., Слудский А.А., Удовиков А.И., Аникин В.В., Яковлев С.А., Караваева Т.Б. К роли нематод (Secernentea, Rhabdidae) - паразитов блох в энзоотии чумы. Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. 2006; 5:88-92.Popov N.V., Sludsky A.A., Udovikov A.I., Anikin V.V., Yakovlev S.A., Karavaeva T.B. [Concerning the role of nematodes (Secernentea, Rhabdidae) - flea parasites in plague enzootics]. Entomologicheskie i Parazitologicheskie Issledovaniya v Povolzhie [Entomological and Parasitological Studies in Volga River Basin]. 2006; 5:88-92.Darby C. Uniquely insidious: Yersinia pestis biofilms. Trends Microbiol. 2008; 16(4):158-64. DOI: 10.1016/j.tim.2008.01.005.Darby C. Uniquely insidious: Yersinia pestis biofilms. Trends Microbiol. 2008; 16(4):158-64. DOI: 10.1016/j.tim.2008.01.005.Hinnebusch B., Erickson D. Yersinia pestis biofilm in the flea vector and its role in the transmission of plague. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008; 322:229-48. DOI: 10.1007/978-3-540-75418-311.Hinnebusch B., Erickson D. Yersinia pestis biofilm in the flea vector and its role in the transmission of plague. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008; 322:229-48. DOI: 10.1007/978-3-540-75418-311.Hall-Stoodley L., Costerton J., Stoodley P. Bacterial bio-films: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2):95-108. DOI: 10.1038/nrmicro821.Hall-Stoodley L., Costerton J., Stoodley P. Bacterial bio-films: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2):95-108. DOI: 10.1038/nrmicro821.Кошель Е.И., Ерошенко Г.А., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Широков А.А., Буров А.М., Кузнецов О.С., Кутырев В.В. Оценка длительности сохранения штаммов Yersinia pestis в клетках почвенных амеб Acanthamoeba sp. в экспериментальных условиях. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 2:69-74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-69-74.Koshel’ E.I., Eroshenko G.A., Anisimova L.V., Novichkova L.A., Shirokov A.A., Burov A.M., Kuznetsov O.S., Kutyrev V.V. [Exploratory study of the long-term persistence of Yersinia pestis in the cells of soil-inhabiting ameba - Acanthamoeba Sp.] Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 2:69-74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-69-74.Никульшин С. В., Онацкая Т Г., Луканина Л. М. Изучение ассоциации почвенных амеб Hartmannella rhysodes с бактериями - возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1992; 69(9-10):2-4.Nikul’shin S.V., Onatskaya T.G., Lukanina L.M. [Associations of the soil amoeba Hartmannella rhysodes with the bacterial causative agents of plague and pseudotuberculosis in an experiment]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology, and Immunobiology]. 1992; 9-10:2-5.Zhang X., Cui Z., Wang D. Sensing of biomolecular interactions using fluorescence complementing systems in living cells. Biosens. Bioelectron. 2016; 76:243-50. DOI: 10.1016/j.bios.2015.07.069.Zhang X., Cui Z., Wang D. Sensing of biomolecular in-teractions using fluorescence complementing systems in living cells. Biosens. Bioelectron. 2016; 76:243-50. DOI: 10.1016/j.bios.2015.07.069.Sarcar P., Chattopadhyay A. GFP fluorescence: A few lesser-known nuggets that make it work. J. Biosci. 2018; 43(3):421-30. DOI: 10.1007/s12038-018-9779-9.Sarcar P, Chattopadhyay A. GFP fluorescence: A few lesser-known nuggets that make it work. J. Biosci. 2018; 43(3):421-30. DOI: 10.1007/s12038-018-9779-9.Forde C., Rocco J., Fitch J., McCutchen-Maloney S. Real-time characterization of virulence factor expression in Yersinia pestis using a GFP reporter system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324(2):795-800. DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.08.236.Forde C., Rocco J., Fitch J., McCutchen-Maloney S. Real-time characterization of virulence factor expression in Yersinia pestis using a GFP reporter system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324(2):795-800. DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.08.236.Gensberger E., Kostic T. Green fluorescent protein label¬ing of food pathogens Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudo-tuberculosis. J. Microbiol. Meth. 2017; 132:21-6. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.11.008.Gensberger E., Kostic T. Green fluorescent protein labeling of food pathogens Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. J. Microbiol. Meth. 2017; 132:21-6. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.11.008.Su S., Bangar H., Saldanha R., Pemberton A., Aronow B., Dean G., Lamkin T., Hassett D.J. Construction and characterization of stable, constitutively expressed, chromosomal green and red fluorescent transcriptional fusions in the select agents, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. MicrobiologyOpen. 2014; 3(5):610-29. DOI: 10.1002/mbo3.192.Su S., Bangar H., Saldanha R., Pemberton A., Aronow B., Dean G., Lamkin T., Hassett D.J. Construction and characterization of stable, constitutively expressed, chromosomal green and red fluorescent transcriptional fusions in the select agents, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. MicrobiologyOpen. 2014; 3(5):610-29. DOI: 10.1002/mbo3.192.Shagin D.A., Barsova E.V., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Labas Y.A., Semenova T.N., Ugalde J.A., Meyers A., Nunez J.M., Widder E.A., Lukyanov S.A., Matz M.V GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol. Biol. Evol. 2004; 21(5):841-50. DOI: 10.1093/molbev/msh079.Shagin D.A., Barsova E.V., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Labas Y.A., Semenova T.N., Ugalde J.A., Meyers A., Nunez J.M., Widder E.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol. Biol. Evol. 2004; 21(5):841-50. DOI: 10.1093/molbev/msh079.Conchas R.F., Carniel E. A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia. Gene. 1990; 87(1):133-7. DOI: 10.1016/0378-1119(90)90505-L.Conchas R.F., Carniel E. A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia. Gene. 1990; 87(1):133-7. DOI: 10.1016/0378-1119(90)90505-L.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases: Practice Guidelines]. Moscow: “Shiko”; 2013. 560 p.Kado C., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365-73. PMID: 7009583. PMCID: PMC217141.Kado C., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365-73. PMID: 7009583. PMCID: PMC217141.Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ; 1970. 367 с.Plokhinsky N.A. Biometrics. Moscow: MSU Publishing House; 1970. 367 p.Балахонов С.В., Афанасьев М.В., Шестопалов М.Ю., Остяк А.С., Витязева С.А., Корзун В.М., Вержуцкий Д.Б., Михайлов Е.П., Мищенко А.И., Денисов А.В., Ивженко Н.И., Рождественский Е.Н., Висков Е.Н., Фомина Л.А. Первый случай выделения Yersinia pestis subsp. pestis в Алтайском горном природном очаге чумы. Сообщение I. Микробиологическая характеристика, молекулярно-генетическая и масс-спектрометрическая идентификация изолята. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 1:60-5. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-60-65.Balakhonov S.V., Afanas’ev M.V., Shestopalov M.Yu., Ostyak A.S., Vityazeva S.A., Korzun V.M., Verzhutsky D.B., Mikhailov E.P., Mishchenko A.I., Denisov A.V., Ivzhenko N.I., Rozhdestvensky E.N., Viskov E.N., Fomina L.A. [The first case of Yersinia pestis subsp. pestis isolation in the territory of Altai mountain natural plague focus. Communication 1. Microbiological characteristics, molecular-genetic and mass-spectrometric identification of the isolate]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; 1:60-5. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-60-65.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.