microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2020-2-91-97microbe-1331Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПолногеномное секвенирование и филогенетический анализ вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГWhole-Genome Sequencing and Phylogenetic Analysis of Francisella tularensis Vaccine Strain 15 NIIEGНарышкинаЕ. А.NaryshkinaE. A.

Ekaterina A. Naryshkina

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruКрасновЯ. М.KrasnovYa. M.rusrapi@microbe.ruАльховаЖ. В.AlhovaZh. V.rusrapi@microbe.ruБаданинД. В.BadaninD. V.rusrapi@microbe.ruОсинА. В.OsinA. V.rusrapi@microbe.ruЛяшоваО. Ю.LyashovaO. Yu.rusrapi@microbe.ruСаяпинаЛ. В.SayapinaL. V.БондаревВ. П.BondarevV. P.МеркуловВ. А.MerkulovV. A.ОлефирЮ. В.OlefirYu. V.КутыревВ. В.KutyrevV. V.rusrapi@microbe.ruФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian FederationФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохраненияРоссияScientific Center on Expertise of Medical Application ProductsRussian Federation202011072020029197Copyright © Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В., 20202020Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В.Naryshkina E.A., Krasnov Y.M., Alhova Z.V., Badanin D.V., Osin A.V., Lyashova O.Y., Sayapina L.V., Bondarev V.P., Merkulov V.A., Olefir Y.V., Kutyrev V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1331

Целью исследования стало проведение полногеномного секвенирования вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ, а также определение на основании полученных результатов его филогенетических связей и особенностей генетической организации.

Материалы и методы

Материалы и методы. Полногеномное секвенирование штамма F. tularensis 15 НИИЭГ осуществляли на платформах Ion PGM (Ion Torrent, США) и MinIon (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания). Выравнивание полученных прочтений на полный геном штамма F. tularensis subsp. holarctica LVS (CP009694, США, 2015 г.) осуществляли с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene 15.3. Гибридную сборку ридов в контиги осуществляли с помощью программы Unicycler v. 0.4.4, используя данные, полученные по технологии полупроводникового секвенирования (Ion PGM) и секвенирования через нанопоры (MinIon). Филогенетический анализ выполняли на основе данных о найденных единичных нуклеотидных заменах (SNPs), находящихся в коровой части генома F. tularensis. Для построения дендрограммы по полученным данным общей SNP-матрицы использовали алгоритм Maximum parsimony.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Подтверждено близкое родство штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с вакцинным штаммом F. tularensis LVS, который используется в странах Западной Европы и Северной Америки. При поиске общих единичных мутаций, характерных для вакцинных штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS, найдены 5 уникальных SNPs, отличающих их от других 228 штаммов F. tularensis, используемых при сравнении. Геномный анализ вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ относительно вирулентных штаммов выявил в его структуре две протяженные делеции размером 526 п.н. (гены pilA и pilE) и 1480 п.н. (гены, кодирующие липопротеин). Аналогичные делеции присутствуют и в геноме вакцинного штамма F. tularensis LVS.

Objective of the study was to conduct whole-genome sequencing of the vaccine strain Francisella tularensis 15 NIIEG and determine, based on the results, its phylogenetic relationships and the genetic organization features.

Materials and methods

Materials and methods. Whole-genome sequencing of F. tularensis 15 NIIEG strain was performed on Ion PGM (Ion Torrent, USA) and MinIon (Oxford Nanopore Technologies, UK) platforms. Alignment of readings obtained to the whole-genome of F. tularensis subsp. holarctica LVS (CP009694, USA, 2015) was performed using the software package DNASTAR Lasergene 15.3. Hybrid assembly of reads into contigs was performed by means of Unicycler v. 0.4.4, using data obtained by semiconductor sequencing technology (Ion PGM) and nanopore sequencing (MinIon). Phylogenetic analysis was performed on the basis of single nucleotide polymorphism (SNPs) data located in the core part of F. tularensis genome. Maximum parsimony algorithm was used to construct a dendrogram using the obtained data of common SNP-matrix.

Results and discussion

Results and discussion. The close relations of F. tularensis 15 NIIEG strain with F. tularensis LVS vaccine strain used in the countries of Western Europe and North America was confirmed. Searching for common single mutations characteristic of F. tularensis 15 vaccine strains of NIIEG and LVS, permitted to find 5 unique SNPs that distinguish them from all other 228 F. tularensis strains used in the comparison. Comparative genomic analysis ofF. tularensis 15 NIIEG vaccine strain and virulent strains revealed in its structure two extensive 526 bp deletions (genes pilA and pilE) and 1480 bp (genes encoding lipoprotein). Similar deletions are also present in the genome of the F. tularensis LVS vaccine strain.

полногеномное секвенированиефилогенетический анализFrancisella tularensisвакцинный штаммwhole-genome sequencingphylogenetic analysisFrancisella tularensisvaccine strainReferencesПавлов В.М., Дятлов И.А. Молекулярно-генетические исследования бактерий рода Francisella и их прикладное значение. М.: ООО «ТиРу»; 2012. 267 с.Pavlov V.M., Dyatlov I.A. Molecular Genetic Studies of Bacteria of the Genus Francisella and Their Applied Value. M.: LLC “TiRu”; 2012.267 p.Мещерякова И.С., Добровольский А.А., Демидова Т.Н., Кормилицына М.И., Михайлова Т.В. Трансмиссивная эпидемическая вспышка туляремии в г. Ханты-мансийске в 2013 году. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 5:14–20.Meshcheryakova I.S., Dobrovolsky A.A., Demidova T.N., Kormilitsyna M.I., Mikhailova T.V. Transmissible epidemic outbreak of tularemia in Khanty-Mansiysk in 2013. Epidemiologia I Vaktsynoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2014; 5:14–20.Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Павлов В.М. Получение штамма туляремийного микроба без одной копии гена iglC и без гена recA. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; 31(4):33–9.Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Titareva G.M., Bakhteeva I.V., Mironova R.I., Kombarova T.I., Kravchenko T.B., Dyatlov I.A., Pavlov V.M. Obtaining a strain of tularemia microbe without one copy of the iglC gene and without recA gene. Molekularnaya Genetika, Mikrobiologia i Virusologia [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2015; 31 (4):33–3.Избанова У.А., Куница Т.Н., Лухнова Л.Ю. Достижения в области специфической профилактики туляремии. Medicine (Almaty). 2016; 10:49–59.Izbanova U.A., Kunitsa T.N., Lukhnova L.Yu. Achievements in the field of specific prevention of tularemia. Medicine (Almaty). 2016; 10:49–59.Sandstrцm G. The Tularaemia Vaccine. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994; 59(4):315–20. DOI: 10.1002/jctb.280590402.Sandstrцm G. The Tularaemia Vaccine. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994; 59(4):315–20. DOI: 10.1002/jctb.280590402.Ellis J., Oyston. P.C., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clinical. Microbiol. Rev. 2002; 15(4):631–46. DOI: 10.1128/ CMR.15.4.631–646.2002.Ellis J., Oyston. P.C., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clinical. Microbiol. Rev. 2002; 15(4):631–46. DOI: 10.1128/ CMR.15.4.631–646.2002.Reed D.S., Smith L.P., Cole K.S., Santiago A.E., Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 82(5):2098–105. DOI: 10.1128/IAI.01498-14.Reed D.S., Smith L.P., Cole K.S., Santiago A.E., Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 82(5):2098–105. DOI: 10.1128/IAI.01498-14.Jia Q., Horwitz M.A. Live Attenuated Tularemia Vaccines for Protection Against Respiratory Challenge With Virulent F. tularensis subsp. tularensis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2018; 8:154. DOI: 10.3389/fcimb.2018.00154.Jia Q., Horwitz M.A. Live Attenuated Tularemia Vaccines for Protection Against Respiratory Challenge With Virulent F. tularensis subsp. tularensis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2018; 8:154. DOI: 10.3389/fcimb.2018.00154.Titball R.W., Oyston P.C.F. A vaccine for tularaemia. Expert. Opin. Biol. Ther. 2003; 3(4):645–53. DOI: 10.1517/14712598.3.4.645.Titball R.W., Oyston P.C.F. A vaccine for tularaemia. Expert. Opin. Biol. Ther. 2003; 3(4):645–53. DOI: 10.1517/14712598.3.4.645.Kadzhaev K., Zingmark C., Golovliov I., Bolanowski M., Shen H., Conlan W., Sjцstedt A. Identification of Genes Contributing to the Virulence of Francisella tularensis SCHU S4 in a Mouse Intradermal Infection Model. PLoS ONE. 2009; 4(5):e5463. DOI: 10.1371/journal.pone.0005463.Kadzhaev K., Zingmark C., Golovliov I., Bolanowski M., Shen H., Conlan W., Sjцstedt A. Identification of Genes Contributing to the Virulence of Francisella tularensis SCHU S4 in a Mouse Intradermal Infection Model. PLoS ONE. 2009; 4(5):e5463. DOI: 10.1371/journal.pone.0005463.Sammons-Jackson W.L., McClelland K., Manch-Citron J.N., Metzger D.W., Bakshi C.S., Garcia E., Rasley A., Anderson B.E. Generation and Characterization of an Attenuated Mutant in a Response Regulator Gene of Francisella tularensis Live Vaccine Strain (LVS). DNA Cell Biol. 2008; 27(7):387–403. DOI: 10.1089/dna.2007.0687.Sammons-Jackson W.L., McClelland K., Manch-Citron J.N., Metzger D.W., Bakshi C.S., Garcia E., Rasley A., Anderson B.E. Generation and Characterization of an Attenuated Mutant in a Response Regulator Gene of Francisella tularensis Live Vaccine Strain (LVS). DNA Cell Biol. 2008; 27(7):387–403. DOI: 10.1089/dna.2007.0687.Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H., Forsman M., Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller SI. Potential source of Francisella tularensis live vaccine strain attenuation determined by genome comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12):6895–906. DOI: 10.1128/IAI.01006-06.Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H., Forsman M., Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller SI. Potential source of Francisella tularensis live vaccine strain attenuation determined by genome comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12):6895–906. DOI: 10.1128/IAI.01006-06.Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrцm M., Forsman M., Johansson A. Evolution of Subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903–8. DOI: 10.1128/JB.187.11.3903–3908.2005.Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrцm M., Forsman M., Johansson A. Evolution of Subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903–8. DOI: 10.1128/JB.187.11.3903–3908.2005.Forslund A.L., Kuoppa K., Svensson K., Salomonsson E., Johansson A., Bystrцm M., Oyston P.C., Michell S.L., Titball R.W., Noppa L., Frithz-Lindsten E., Forsman M., Forsberg A. Direct repeat-mediated deletion of a type IV pilin gene results in major virulence attenuation of Francisella tularensis. Mol. Microbiol. 2006; 59(6):1818–30. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05061.x.Forslund A.L., Kuoppa K., Svensson K., Salomonsson E., Johansson A., Bystrцm M., Oyston P.C., Michell S.L., Titball R.W., Noppa L., Frithz-Lindsten E., Forsman M., Forsberg A. Direct repeat-mediated deletion of a type IV pilin gene results in major virulence attenuation of Francisella tularensis. Mol. Microbiol. 2006; 59(6):1818–30. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05061.x.Salomonsson E., Forsberg A., Roos N., Holz C., Maier B., Koomey M., Winther-Larsen H.C. Functional analyses of pilin-like proteins from Francisella tularensis: complementation of type IV pilus phenotypes in Neisseria gonorrhoeae. Microbiology. 2009; 155(Pt 8):2546–59. DOI: 10.1099/mic.0.028183-0.Salomonsson E., Forsberg A., Roos N., Holz C., Maier B., Koomey M., Winther-Larsen H.C. Functional analyses of pilin-like proteins from Francisella tularensis: complementation of type IV pilus phenotypes in Neisseria gonorrhoeae. Microbiology. 2009; 155(Pt 8):2546–59. DOI: 10.1099/mic.0.028183-0.кормилицына м.и., мещерякова и.с., михайлова т.в. молекулярно-генетическая характеристика штаммов Francisella tularensis, различающихся по таксономической принадлежности и вирулентности. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013; 3:22–5.Kormilitsyna M.I., Meshcheryakova I.S., Mikhailova T.V. Molecular genetic characteristics of strains of Francisella tularensis, differing in taxonomic affiliation and virulence. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologia I Virusologia [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2013; 3:22–5.Forsberg A., Guina T. Type II secretion and type IV pili of Francisella. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:187–201. DOI: 10.1196/annals.1409.016.Forsberg A., Guina T. Type II secretion and type IV pili of Francisella. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:187–201. DOI: 10.1196/annals.1409.016.Jaing C.J., McLoughlin K.S., Thissen J.B., Zemla A., Gardner S.N., Vergez L.M., Bourguet F., Mabery S., Fofanov V.Y., Koshinsky H., Jackson P.J. Identification of Genome-Wide Mutations in Ciprofloxacin-Resistant F. tularensis LVS Using Whole Genome Tiling Arrays and Next Generation Sequencing. PLoS ONE. 2016; 11(9):e0163458. DOI: 10.1371/journal.pone.0163458.Jaing C.J., McLoughlin K.S., Thissen J.B., Zemla A., Gardner S.N., Vergez L.M., Bourguet F., Mabery S., Fofanov V.Y., Koshinsky H., Jackson P.J. Identification of Genome-Wide Mutations in Ciprofloxacin-Resistant F. tularensis LVS Using Whole Genome Tiling Arrays and Next Generation Sequencing. PLoS ONE. 2016; 11(9):e0163458. DOI: 10.1371/journal.pone.0163458.Qin A., Scott D.W., Thompson J.A., Mann B.J. Identifi of an essential Francisella tularensis subsp. tularensis virulence factor. Infect. Immun. 2009; 77(1):152–61. DOI: 10.1128/IAI.01113-08.Qin A., Scott D.W., Thompson J.A., Mann B.J. Identifi of an essential Francisella tularensis subsp. tularensis virulence factor. Infect. Immun. 2009; 77(1):152–61. DOI: 10.1128/IAI.01113-08.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.