microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2020-2-115-121microbe-1335Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРекомбинантные ретровирусные частицы: технология получения и использование в качестве положительных контрольных образцов для ПЦР-диагностики опасных вирусных инфекцийRecombinant Retroviral Particles: Technology of Poduction and Application as Positive Controls for PCR Diagnostics of Dangerous Viral Infectionshttps://orcid.org/0000-0003-4664-4752ФоминаЕ. Г.FominaE. G.

Фомина Елена Георгиевна

Минск, ул. Филимонова, 23

Elena G. Fomina

23, Filimonova St., Minsk, 220114

feg1@tut.byhttps://orcid.org/0000-0003-3919-0625ГригорьеваЕ. Е.GrigorievaE. E.https://orcid.org/0000-0001-6927-5043ВладыкоА. С.VladykoA. S.ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии»БеларусьRepublican Research and Practical Center of Epidemiology and MicrobiologyBelarus20201207202002115121Copyright © Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Владыко А.С., 20202020Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Владыко А.С.Fomina E.G., Grigorieva E.E., Vladyko A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1335

Цель работы – разработка технологии получения положительных контрольных образцов на основе рекомбинантных ретровирусных частиц, а также ее применение при создании наборов реагентов для выявления РНК возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Материалы и методы

Материалы и методы. Для выполнения исследований использованы молекулярнобиологические, генно-инженерные и иммунологические методы: полимеразная цепная реакция, рестрикция, лигирование, клонирование, трансформация, трансфекция и цитофлуориметрия.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Разработана и апробирована технология получения положительных контрольных образцов на основе рекомбинантных вирионов, включающая в себя создание генноинженерной конструкции на базе ретровирусного вектора с клонированной в него диагностической последовательностью вирусного генома; получение «пакующей» клеточной линии, продуцирующей химерные ретровирусные частицы; определение титра рекомбинантных вирионов методом проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции; использование полученного на их основе препарата в качестве положительного контрольного образца при ПЦР-диагностике инфекционного агента. Технология использования ретровирусных векторов как носителей фрагментов РНК-геномных вирусов применена при разработке тест-систем для ПЦР-диагностики опасных и особо опасных вирусных инфекций, что позволило повысить эксплуатационные качества диагностических наборов и исключить на этапе их производства работу с концентрированными инфекционными агентами, относящимися к 3 и 4 группам риска по классификации ВОЗ (вирусы Ласса, клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита и возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом).

Objective

Objective. Construction of positive control samples based on recombinant retroviral particles and their application in RT-PCR diagnostic assays for RNA detection of agents of dangerous and particularly dangerous viral infections.

Materials and methods

Materials and methods. Molecular biological, genetic engineering, and immunological methods were used: polymerase chain reaction, restriction, ligation, cloning, transformation, transfection, flow cytometry.

Results and discussion

Results and discussion. Technology of positive control samples producing based on recombinant virions has been developed and tested. It includes construction of retroviral vector with cloned diagnostic sequence of the viral genome; obtaining a packaging cell line producing chimeric retroviral particles; determination of recombinant virions titer by flow cytometry and polymerase chain reaction; application of the obtained preparation as a control sample for PCR diagnostics of infectious agents. Positive controls based on retroviral vectors as carriers of genomic RNA fragments of pathogenic viruses were used in the development of PCR diagnostic kits for dangerous and particularly dangerous viral infections. Their application increased the kits quality and made it possible to exclude the work with concentrated hazardous infectious agents (Lassa virus, tick-borne encephalitis virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Puumala virus).

рнк-содержащие вирусымолекулярно-генетическая диагностикарекомбинантные ретровирусные частицыположительный контрольный образецRNA-containing virusesmolecular-genetic diagnosticsrecombinant retroviral particlespositive controlReferences. Сизикова Т.Е., Мельникова Е.В., Маношкин А.В., Петров А.А., Мельников Д.Г., Пантюхин В.Б., Лебедев В.Н., Борисевич С.В. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3:41–4.Syzykova T.Ye., Melnikova Ye.V., Manoshkin A.V., Petrov A.A., Melnikov D.G., Pantyukhov V.B., Lebedev V.N., Borisevitch. Петров А.А., Лебедев В.Н., Казанцев А.В., Ковальчук Е.А., Сизикова Т.Е., Пышная Н.С., Павельев Д.И., Кутаев Д.А., Борисевич С.В. Использование генно-инженерных конструкций в качестве контрольных образцов при оценке наборов реагентов для выявления РНК возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций методом обратной транскрипцииполимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(6):372–5. DOI: 10.18821/0869-2084-2018-636-372-375S.V. The application of external and internal control objects in case of using of polymerase chain reaction and reverse transcription of polymerase chain reaction Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics]. 2013; 3:41–4.Mikel P., Vasickova P., Kralik P. Methods for preparation of MS2 phage-like particles and their utilization as process control viruses in RT-PCR and qRT-PCR detection of RNA viruses from food matrices and clinical specimens. Food Environ. Virol. 2015; 7(2):96–111. DOI: 10.1007/s12560-015-9188-2.Petrov A.A., Lebedev V.N., Kazantsev A.V., Kovalchuk E.A., Sizikova T.E., Pyshnaya N.S., Paveliev D.I., Kutaev D.A., Borisevich S.V. The use of genetic engineering constructions as control samples on evaluation of diagnostic kits for reveal of RNA of hazard and extremely hazard agents of virus infections by reverse transcription polymerase chain reaction. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics]. 2018; 63(6):372–5. DOI: 10.18821/0869-2084-2018-63-6-372-375.Ninove L., Nougairede A., Gazin C., Thirion L., Delogu I., Zandotti C., Charrel R.N., De Lamballerie X. RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology: a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests. PLoS One. 2011; 6(2):e16142. DOI: 10.1371/journal.pone.0016142.Mikel P., Vasickova P., Kralik P. Methods for preparation of MS2 phage-like particles and their utilization as process control viruses in RT-PCR and qRT-PCR detection of RNA viruses from food matrices and clinical specimens. Food Environ. Virol. 2015; 7(2):96–111. DOI: 10.1007/s12560-015-9188-2.Wen A., Steinmetz N. Design of virus-based nanomaterials for medicine, biotechnology, and energy. Chem. Soc. Rev. 2016; 45(15):4074–126. DOI: 10.1039/c5cs00287g.Ninove L., Nougairede A., Gazin C., Thirion L., Delogu I., Zandotti C., Charrel R.N., De Lamballerie X. RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology: a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests. PLoS One. 2011; 6(2):e16142. DOI: 10.1371/journal.pone.0016142.Fu Y., Wang G., Wu Q., Yang X., Zhang R., Zhang K., Lin G., Han Y., Bao L., Li Z., Li J. Preparation of MS2-based nanoparticles as control and standard materials for the molecular detection of Dengue virus serotypes. Virus Res. 2017; 233:42–50. DOI: 10.1016/j. virusres.2017.02.011.Wen A., Steinmetz N. Design of virus-based nanomaterials for medicine, biotechnology, and energy. Chem. Soc. Rev. 2016; 45(15):4074–126. DOI: 10.1039/c5cs00287g.Mattiuzzo G., Ashall J., Doris K.S., MacLellan-Gibson K., Nicolson C., Wilkinson D.E., Harvey R., Almond N., Anderson R., Efstathiou S., Minor P.D., Page M. Development of lentivirusbased reference materials for Ebola virus nucleic acid amplification technology-based assays. PLoS One. 2015; 10(11):e0142751. DOI: 10.1371/journal.pone.0142751.Fu Y., Wang G., Wu Q., Yang X., Zhang R., Zhang K., Lin G., Han Y., Bao L., Li Z., Li J. Preparation of MS2-based nanoparticles as control and standard materials for the molecular detection of Dengue virus serotypes. Virus Res. 2017; 233:42–50. DOI: 10.1016/j. virusres.2017.02.011.Dedkov V., Magassouba N., Safonova M., Naydenova E., Ayginin A., Soropogui B., Kourouma F., Camara A., Camara J., Kritzkiy A., Tuchkov I., Shchelkanov M., Maleev V. Development and evaluation of a one-step quantitative RT-PCR assay for detection of Lassa virus. J. Virol. Methods. 2019; 271:113674. DOI: 10.1016/j. jviromet.2019.113674.Mattiuzzo G., Ashall J., Doris K.S., MacLellan-Gibson K., Nicolson C., Wilkinson D.E., Harvey R., Almond N., Anderson R., Efstathiou S., Minor P.D., Page M. Development of lentivirusbased reference materials for Ebola virus nucleic acid amplification technology-based assays. PLoS One. 2015; 10(11):e0142751. DOI: 10.1371/journal.pone.0142751.Gholami M., Ravanshad M., Baesi K., Samiee S., Rozbahani N., Mohraz M. Preparation and evaluation of ribonuclease-resistant viral HIV RNA standards based on armored RNA technology. Iran Biomed J. 2018; 22(6):394–400. DOI: 10.29252/.22.6.394.Dedkov V., Magassouba N., Safonova M., Naydenova E., Ayginin A., Soropogui B., Kourouma F., Camara A., Camara J., Kritzkiy A., Tuchkov I., Shchelkanov M., Maleev V. Development and evaluation of a one-step quantitative RT-PCR assay for detection of Lassa virus. J. Virol. Methods. 2019; 271:113674. DOI: 10.1016/j. jviromet.2019.113674.. Землянский В.А., Дедюля К.Л., Поклонская Н.В., Амвросьева Т.В. Векторная конструкция для накопления армированной РНК. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2015; 2:19–22.Gholami M., Ravanshad M., Baesi K., Samiee S., Rozbahani N., Mohraz M. Preparation and evaluation of ribonuclease-resistant viral HIV RNA standards based on armored RNA technology. Iran Biomed J. 2018; 22(6):394–400. DOI: 10.29252/.22.6.394.Mikel P., Vasickova P., Tesarik R., Malenovska H., Kulich P., Vesely T., Kralik P. Preparation of MS2 phage-like particles and their use as potential process control viruses for detection and quantification of enteric RNA viruses in different matrices. Front. Microbiol. 2016; 7:1911. DOI: 10.3389/fmicb.2016.01911.Zemlyansky V.A., Dedyulya K.L., Poklonskaya N.V., Amvros’eva T.V. [Vector design for accumulation of reinforced RNA]. Vestnik Natsional’noi Akademii Nauk Belarusi [Bulletin of the National Academy of Sciences of Belarus. Medical Science series]. 2015; 2:19–22.Borghetti I., Zambenedetti M., Requiгo L., Vieira D., Krieger M., Pontello Rampazzo R. External control viral-like particle construction for detection of emergent arboviruses by real-time reverse-transcription PCR. BioMed Res. Int. 2019; 2019:2560401. DOI: 10.1155/2019/2560401.Mikel P., Vasickova P., Tesarik R., Malenovska H., Kulich P., Vesely T., Kralik P. Preparation of MS2 phage-like particles and their use as potential process control viruses for detection and quantification of enteric RNA viruses in different matrices. Front. Microbiol. 2016; 7:1911. DOI: 10.3389/fmicb.2016.01911.Куликов С.М., Судариков А.Б., Глинщикова О.А. Внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С в конкурентной полимеразной цепной реакции. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004; 6:84–8.Borghetti I., Zambenedetti M., Requiгo L., Vieira D., Krieger M., Pontello Rampazzo R. External control viral-like particle construction for detection of emergent arboviruses by real-time reverse-transcription PCR. BioMed Res. Int. 2019; 2019:2560401. DOI: 10.1155/2019/2560401.Wang X., Liu F., Jiang L., Bao Y., Xiao Y., Wang H. Use of chimeric influenza viruses as a novel internal control for diagnostic rRT-PCR assays. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016; 100(4):1667– 76. DOI: 10.1007/s00253-015-7042-y.Kulikov S.M., Sudarikov A.B., Glinshchikova O.A. [Internal standard on the basis of retroviral vector for the detection of Hepatitis C virus in competitive polymerase chain reaction]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology, and Immunobiology]. 2004; 6:84–8.Zhou D., Li Y., Li J., Yu J., Yang H., Wei H. Construction of lentivirus-based reference material for RT-PCR detection of Middle East Respiratory Syndrome coronavirus and its application in external quality assessment. J. Nanosci. Nanotechnol. 2019; 19(9):5510– 16. DOI: 10.1166/jnn.2019.16591.Wang X., Liu F., Jiang L., Bao Y., Xiao Y., Wang H. Use of chimeric influenza viruses as a novel internal control for diagnostic rRT-PCR assays. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016; 100(4):1667– 76. DOI: 10.1007/s00253-015-7042-y.Sambrook J., Russell D.W., editors. Molecular Cloning: a Laboratory Manual: in 3 vol. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Vol. 1. 749 p.Zhou D., Li Y., Li J., Yu J., Yang H., Wei H. Construction of lentivirus-based reference material for RT-PCR detection of Middle East Respiratory Syndrome coronavirus and its application in external quality assessment. J. Nanosci. Nanotechnol. 2019; 19(9):5510– 16. DOI: 10.1166/jnn.2019.16591.Markowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virology. 1988; 167(2):400–6. PMID: 2462307.Sambrook J., Russell D.W., editors. Molecular Cloning: a Laboratory Manual: in 3 vol. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Vol. 1. 749 p.Markowitz D., Goff S., Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 1988; 62(4):1120–4. PMID: 2831375 PMCID: PMC253118.Markowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virology. 1988; 167(2):400–6. PMID: 2462307.Markowitz D., Goff S., Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 1988; 62(4):1120–4. PMID: 2831375 PMCID: PMC253118.Markowitz D., Goff S., Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 1988; 62(4):1120–4. PMID: 2831375 PMCID: PMC253118.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.