microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2020-2-122-128microbe-1336Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПоиск генетических маркеров вируса клещевого энцефалита для его специфичной индикацииSearch for Genetic Markers of Tick-Borne Encephalitis Virus for Its Specific Indication, Genomic Analysishttps://orcid.org/0000-0001-5669-1486ХаммадовН. И.KhammadovN. I.

Хаммадов Наиль Ильдарович

420075, Татарстан, Казань, Научный городок-2

nikhammadov@mail.ruФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFederal Center of Toxicological, Radiation and Biological SafetyRussian Federation20201207202002122128Copyright © Хаммадов Н.И., 20202020Хаммадов Н.И.Khammadov N.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1336

Цель исследования – анализ генетических маркеров вируса клещевого энцефалита, которые можно использовать для специфичной индикации максимально большего числа штаммов и изолятов вируса.

Материалы и методы

Материалы и методы. В качестве амплифицируемого материала использовалась плазмидная ДНК и нуклеиновые кислоты клещей рода Ixodes и Dermacentor. Полимеразную цепную реакцию осуществляли на амплификаторе «C1000» с оптическим блоком «CFX96» (BioRad). Видовое (штаммовое) разнообразие выявляемых с применением анализируемых генетических маркеров организмов определяли в программной утилите «nBLAST». Дизайн нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов проводили, используя программу «Vector NTI 9.1.0» (Invitrogen Corporation). Выделение нуклеиновых кислот производили методом магнитной сорбции с комплектом реагентов «МАГНО-сорб». Праймеры и зонды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Для ПЦР использовались реактивы производства ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

Objective of the study is to analyze the genetic markers of tick-borne encephalitis virus, which can be used to specifically indicate the maximum number of virus strains and isolates.

Materials and methods

Materials and methods. Plasmid DNA and nucleic acids of the tick, the genus Ixodes and Dermacentor, were used as amplified material. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted on C1000 amplifier with a CFX96 optical unit (BioRad). The species (strain) variety of detected organisms, using the analyzed genetic markers, was determined in the nBLAST software utility. The design of the nucleotide sequences of primers and probes was performed using “Vector NTI 9.1.0” (Invitrogen Corporation). Nucleic acids were isolated by magnetic sorption with a reagent panel MAGNO-sorb. Primers and probes were synthesized at “Evrogen” company, Moscow, Russia. The reagents for PCR were manufactured by “Syntol” company, Moscow, Russia.

Results and discussion

Results and discussion. When indicating the genome of the tick-borne encephalitis virus, the main criterion for choosing a marker sequence is the specific detection of nucleic acids of only the desired microorganism. The genomewide nucleotide sequences of various strains and isolates of tick-borne encephalitis virus were analyzed to search for a specific marker nucleotide sequence. Mutual comparison of all the above mentioned genomes made it possible to determine 7 conventionally conservative loci characterized by minimal nucleotide variability. The further work was based on the results of alignment of the nucleotide sequences of tick-borne encephalitis virus isolates, including the nucleotide sequences of heterogeneous microorganisms; primers and probes were designed to amplify each of the marker loci; the most analytically significant oligonucleotides were developed based on loci 4 and 7. Amplification with oligonucleotide primers to indicate tick-borne encephalitis virus was effective, both in a separate PCR with a positive control, and in combination with tick DNA.

вирус клещевого энцефалитаспецифичностьполиморфизм геномапцрлокусыгенетические маркерыолигонуклеотидыиндикацияTick-borne encephalitis virusspecificitygenome polymorphismPCRlocigenetic markersoligonucleotidesindicationReferencesТуник Т.В., Ляпунов А.В., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Арбатская Е.В., Чапоргина Е.А., Каверзина А.С., Петрова И.В., Савелькаева М.В., Горбунова Е.Л. Эффективность антибиотикопрофилактики болезни Лайма (клещевого боррелиоза) у лиц, пострадавших от укусов иксодовых клещей. Acta Biomedica Scientifica. 2012; (2–1):67–70.Tunik T.V., Lyapunov A.V., Khasnatinov M.A., Danchinova G.A., Arbatskaya E.V., Chaporgina E.A., Kaverzina A.S., Petrova I.V., Savel’kaeva M.V., Gorbunova E.L. [The effectiveness of antibiotic prophylaxis of Lyme disease (tick-borne borreliosis) in individuals affected by bites of ixodid ticks]. Acta Biomedica Scientifica. 2012; (2–1):67–70.Madison-Antenucci S., Kramer L.D., Gebhardt L.L., Kauffman E. Emerging tick-borne diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2020; 33(2):e00083-18. DOI: 10.1128/CMR.00083-18.Madison-Antenucci S., Kramer L.D., Gebhardt L.L., Kauffman E. Emerging tick-borne diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2020; 33(2):e00083-18. DOI: 10.1128/CMR.00083-18.Ляпунов А.В., Данчинова Г.А., Хаснатинов М.А., Туник Т.В., Арбатская Е.В., Петрова И.В., Савелькаева М.В., Горбунова Е.Л., Гладкова Е.П. Встречаемость антигена вируса клещевого энцефалита у населения, пострадавшего от укусов иксодовых клещей. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2013; (2–2):115–8.Lyapunov A.V., Danchinova G.A., Khasnatinov M.A., Tunik T.V., Arbatskaya E.V., Petrova I.V., Savelkaeva M.V., Gorbunova E.L., Gladkova E.P. [The incidence of tick-borne encephalitis virus antigen in a population affected by tick bites]. Byulleten’ VostochnoSibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniya Rossijskoj akademii meditsinskih nauk. [Bulletin of the East Siberian Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2013; (2–2):115–8.Оглезнева Е.Е., Ильина Т.М., Чеботарева Т.Я. Ситуация по заболеваемости инфекциями, передающимися при укусах клещей, и мерах их профилактики на территории Белгородской области за период 2015 – 8 месяцев 2017 гг. Инфекция и иммунитет. 2017; S:476.Oglezneva E.E., Ilina T.M., Chebotareva T.YA. [The situation with the incidence of infections transmitted by tick bites and measures for their prevention in the territory of the Belgorod region for the period 2015 – 8 months of 2017]. Infekciya i immunitet. [Russian journal of Infection and immunity]. 2017; S:476.Данчинова Г.А., Ляпунов А.В., Манзарова Э.Л., Ляпунова Н.А., Соловаров И.С., Петрова И.В., Хаснатинов М.А. Необходимость совершенствования экстренной диагностики клещевых инфекций у людей, пострадавших от укусов иксодовых клещей за пределами России. Acta Biomedica Scientifica. 2018; 3(4):129–37. DOI: 10.29413/ABS.2018-3.4.19.Danchinova G.A., Lyapunov A.V., Manzarova E.L., Lyapunova N.A., Solovarov I.S., Petrova I.V., Khasnatinov M.A. [The need to improve emergency diagnosis of tick-borne infections in people affected by bites of Ixodidae ticks outside of Russia]. Acta Biomedica Scientifica. 2018; 4:129–37. DOI: 10.29413/ABS.20183.4.19.Конев В.П. Клещевой энцефалит: патоморфология и молекулярная патология. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2007; 11:87–90.Konev V.P. [Tick-borne encephalitis: pathomorphology and molecular pathology]. Dal’nevostochnyj zhurnal infektsionnoj patologii. [Far Eastern Journal of Infectious Pathology]. 2007; 11:87–90.Пиневич О.С., Попонникова Т.В., Вахрамеева Т.Н., Бедарева Т.Ю., Галиева Г.Ю., Берданова В.С. Клинические и этиологические аспекты клещевых микст-инфекций у детей. Мать и дитя в Кузбассе. 2008; 3:30–5.Pinevich O.S., Poponnikova T.V., Vahrameeva T.N., Bedareva T.Y., Galieva G.Y., Berdanova V.S. Clinical and etiological aspects of tick-borne mixed infections in children]. Mat’ i ditya v Kuzbasse. [Mother and child in Kuzbass]. 2008; 3:30–5.Леонова Г.Н., Крылова Н.В., Павленко Е.В., Беликов С.И., Кондратьев И.Г. Значение дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита в инфекционной патологии. Здоровье населения и среда обитания. 2012; 1:4–6.Leonova G.N., Krylova N.V., Pavlenko E.V., Belikov S.I., Kondrat’ev I.G. [The importance of Far Eastern tick-borne encephalitis virus strains in infectious pathology]. Zdorov’e naseleniya i sreda obitaniya. [Public Health and Life Environment]. 2012; 1:4–6.Хусаинов Ф.М., Евстифеев В.В., Хусаинова Г.И., Хамидуллина Р.З., Фазулзянов И.Р., Яковлев С.И. Клинико-эпизоотологическое проявление хламидийного аборта у коз. Ветеринарный врач. 2018; 3:41–4.Khusainov F.M., Evstifeev V.V., Khusainova G.I., Khamidullina R.Z., Fazulzyanov I.R., Yakovlev S.I. [Clinical and epizootiological manifestation of chlamydial abortion in goats]. Veterinarnyj vrach [Veterinarian]. 2018; 3:41–4.Гумеров В.Г., Евстифеев В.В., Макаев Х.Н., Галиуллин А.К., Каримуллина И.Г., Коннов М.Н. Эпизоотологический и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2019; 237(1):56–60. DOI: 10.31588/2413-42011883-237-1-56-60.Gumerov V.G., Evstifeev V.V., Makaev H.N., Galiullin A.K., Karimullina I.G., Konnov M.N. [Epizootiological and serological monitoring of mixed respiratory and intestinal infections in cattle]. Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj meditsiny im. N.E. Baumana. [Scientific notes of Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman]. 2019; 1:56–60. DOI: 10.31588/2413-4201-1883-237-1-56-60Этенко Д.А., Громова О.А., Субботин А.В., Семенов В.А. Комплексная терапия очаговой формы смешанной клещевой энцефалит-боррелиозной инфекции. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2016; 8(3):26–30. DOI: 10.14412/2074-2711-2016-3-26-30.Etenko D.A., Gromova O.A., Subbotin A.V., Semenov V.A. [Combined therapy of the focal form of mixed tick-borne encephalitis-borreliosis infection]. Nevrologiya, nejropsikhiatriya, psihosomatika [Neurology, neuropsychiatry, psychosomatics]. 2016; 3:26–30. DOI: 10.14412/2074-2711-2016-3-26-30.Носков А.К., Ильин В.П., Андаев Е.И., Пакскина Н.Д., Веригина Е.В., Балахонов С.В. Заболеваемость клещевым вирусным энцефалитом в российской федерации и по федеральным округам в 2009–2013 гг., эпидемиологическая ситуация в 2014 г. и прогноз на 2015 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; 1:46–50. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-46-50.Noskov A.K., Ilin V.P., Andaev E.I., Pakskina N.D., Verigina E.V., Balahonov S.V. [Tick-borne viral encephalitis incidence in the Russian Federation and federal districts in 2009-2013, epidemiological situation in 2014 and forecast for 2015]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections].. 2015; (1):46–50. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-46-50.Khammadov N.I., Aleksandrova N.M., Khammadova A.V., Shuralev E.A. Evaluation of the Effectiveness of Genetic Markers of Mycobacteria for Assessing the Disinfection Quality by Viability Real Time PCR. BioNanoScience. 2019; 9:918–27. DOI: 10.1007/s12668-019-00654-8.Khammadov N.I., Aleksandrova N.M., Khammadova A.V., Shuralev E.A. Evaluation of the Effectiveness of Genetic Markers of Mycobacteria for Assessing the Disinfection Quality by Viability Real Time PCR. BioNanoScience. 2019; 9:918–27. DOI: 10.1007/s12668-019-00654-8.Khammadova A.V., Shuralev E.A., Khammadov N.I., Oumarou B.M., Faizov T.K., Mukminov M.N. Design of primers for identification of honey bee viruses in multiplex-PCR. Astra Salvensis. 2017; 2017:481–90.Khammadova A.V., Shuralev E.A., Khammadov N.I., Oumarou B.M., Faizov T.K., Mukminov M.N. Design of primers for identification of honey bee viruses in multiplex-PCR. Astra Salvensis. 2017; 2017:481–90.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.