microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2020-3-50-55microbe-1363Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESЭлектрооптический анализ жизнеспособности клеток вакцинного штамма туляремийного микробаElectro-Optical Analysis of Cell Viability of Tularemia Microbe Vaccine Strainhttps://orcid.org/0000-0002-3044-971XВолохО. А.VolokhO. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

lhv@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3793-6526БорисоваС. В.BorisovaS. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruБибиковД. Н.BibikovD. N.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0441-9269КузнецоваЕ. М.KuznetsovaE. M.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruСамохваловаЮ. И.SamokhvalovaYu. I.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruАвдееваН. Г.AvdeevaN. G.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1609-0384КомиссаровА. В.KomissarovA. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruНикифоровА. К.NikiforovA. K.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation202018102020035055Copyright © Волох О.А., Борисова С.В., Бибиков Д.Н., Кузнецова Е.М., Самохвалова Ю.И., Авдеева Н.Г., Комиссаров А.В., Никифоров А.К., 20202020Волох О.А., Борисова С.В., Бибиков Д.Н., Кузнецова Е.М., Самохвалова Ю.И., Авдеева Н.Г., Комиссаров А.В., Никифоров А.К.Volokh O.A., Borisova S.V., Bibikov D.N., Kuznetsova E.M., Samokhvalova Y.I., Avdeeva N.G., Komissarov A.V., Nikiforov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1363Цель

Цель. Изучить возможность применения электрооптического анализа для оценки  жизнеспособности клеток вакцинного штамма туляремийного микроба на этапах получения экспериментальной живой туляремийной вакцины.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектом исследования стала культура клеток Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Исследования проводились на всех этапах получения экспериментальной живой туляремийной вакцины по усовершенствованной технологии: выращивание, концентрирование, диафильтрация, сведение со средами высушивания, стабилизация, хранение (срок наблюдения два года). Электрооптический анализ по  показателю «анизотропия поляризуемости» бактериальной клетки производился с помощью устройства EloTrace (EloSystems, Германия). Общую концентрацию клеток измеряли денситометрически при 590 нм и спектрометрически при 650 нм, оценку жизнеспособности проводили высевом на пластинки с FT-агаром.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В ходе эксперимента показано, что изменение анизотропии поляризуемости клетки при частотах 900 кГц и 2100 кГц, отражающее состояние цитоплазмы и цитоплазматической мембраны соответственно является самым ранним ответом на изменения жизненных показателей бактериальной культуры в процессе выращивания. В свою очередь, снижение жизнеспособности клеток F. tularensis происходило гораздо раньше, чем снижение концентрации клеток. Показано сохранение жизнеспособности клеток F. tularensis 15 НИИЭГ на всех этапах получения экспериментальной живой туляремийной вакцины. Электрооптический анализ позволяет регистрировать изменения жизненных показателей клеток микроорганизма в режиме реального времени, тогда как оценка жизнеспособности бактериологическим методом занимает 5 сут. Различные этапы производства туляремийной вакцины влияют на жизненные показатели клеток F. tularensis, а электрооптический анализ является  перспективным методом контроля показателя «Специфическая активность (количество живых микробных клеток)».

Objective

Objective: to study the possibility of applying electro-optical analysis for the assessment of cell viability of tularemia microbe vaccine strain at different stages of experimental live tularemia vaccine production.

Materials and methods

Materials and methods. The research object was a cell culture of Francisella tularensis 15 NIIEG.  Investigations were carried out at all stages of experimental live tularemia vaccine (ELTV) manufacturing according to an advanced technology: cultivation, concentrating, diafiltration, mixing with drying media, stabilization, and storage (two-year period of observation). Electro-optical analysis by the parameter “polarizability anisotropy” of bacterial cell was conducted with the help of EloTrace (EloSystems, Germany). Total concentration of cells was evaluated using density metering at 590 nm and spectrometry – at 650 nm. Viability was assessed through inoculation of plates with FT-agar.

Results and discussion

Results and discussion. The experiment has demonstrated that the change in polarizability anisotropy of the cell at the frequencies of 900 kHz and 2100 kHz, reflecting the state of cytoplasm and cytoplasmic membrane, respectively, is the earliest response to changes in vital indicators of bacterial culture in the process of cultivation. Thereby, the decrease in viability of F. tularensis cells occurrs well before the decrease in cell concentration. We have shown the preservation of viability of F. tularensis 15 NIIEG cells at all stages of experimental live tularemia vaccine production. Electro-optical analysis allows for registering the changes in vital parameters of microorganism cells in real-time mode, while the assessment of viability applying bacteriological method takes up to 5 days. Different stages of tularemia vaccine manufacturing have impact on the vital indicators of F. tularensis cells, and electro-optical analysis is a prospect method of control of such parameter as “Specific activity (the number of live microbial cells)”.

Francisella tularensisэлектрооптический анализживая туляремийная вакцинаспецифическая активностьFrancisella tularensiselectro-optical analysislive tularemia vaccinespecific activityReferencesМещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология и вакцинопрофилактика (к 80-летию создания первой туляремийной лаборатории в России). Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010; 2(51):17–22.Meshcheryakova I.S. [Tularemia: modern epidemiology and vaccinal prevention (on the 80th anniversary of establishing of the first tularemia laboratory in Russia)]. Epidemiologiya i Vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2010; 2(51):17–22.Дятлов И.А., редактор. Туляремия: состояние проблемы и методы исследования. М.: Династия; 2019. 263 с.Dyatlov I.A., editor. Tularemia: the state of the problem and methods of study. Moscow: “Dinastiya”; 2019. 263 p.Олсуфьев Н.Г., Дунаева Т.Н. Природная очаговость, эпидемиология и профилактика туляремии. М.; 1970. 272 с.Olsuf’ev N.G., Dunaeva T.N. Natural Focality, Epidemiology, and Prophylaxis of Tularemia. М.; 1970. 272 p.Касина И.В., Алексеева С.А., Бердникова З.Е., Немировская Т.И., Алехина А.С. Перспективы совершенствования экспертизы качества вакцины туляремийной живой. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017; 17(4):240–47.Kasina I.V., Alekseeva S.A., Berdnikova Z.E., Nemirovskaya T.I., Alekhina A.S. [Prospects for improving evaluation of live tularemia vaccine quality]. Biopreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie [BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment]. 2017; 17(4):240–47.Волох О.А., Комиссаров А.В., Антонычева М.В., Лобовикова О.А., Авдеева Н.Г., Вахрушина Н.И., Миронова Н.П., Бибиков Д.Н., Никифоров А.К. Совершенствование технологии получения живой туляремийной вакцины. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 3:81–4. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-81-84.Volokh O.A., Komissarov A.V., Antonycheva M.V., Lobovikova O.A., Avdeeva N.G., Vakhrushina N.I., Mironova N.P., Bibikov D.N., Nikiforov A.K. [Enhancement of the technology for live tularemia vaccine production]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (3):81–4. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-81-84.Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Zaitseva I.S., O’Neil D., Ivnitski D. Electrooptical analysis of the Escherichia coli-phage interaction. Anal. Biochem. 2004; 328(2):181–6.Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Zaitseva I.S., O’Neil D., Ivnitski D. Electrooptical analysis of the Escherichia coli-phage interaction. Anal. Biochem. 2004; 328(2):181–6.Junne S., Cruz-Bournazou M.N., Angersbach A., Gotz P. Electrooptical monitoring of cell polarizability and cell size in aerobic Escherichia coli batch cultivations. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2010; 37:935–42. DOI: 10.1007/s10295-010-0742-5.Junne S., Cruz-Bournazou M.N., Angersbach A., Gotz P. Electrooptical monitoring of cell polarizability and cell size in aerobic Escherichia coli batch cultivations. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2010; 37:935–42. DOI: 10.1007/s10295-010-0742-5.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Дятлов И.А. Электрооптический анализ в микробиологии. Серпухов: ФГУН ПМБ ; 2007. 159 с.Ignatov S.G., Voloshin A.G., Bunin V.D., Dyatlov I.A. [Electro-Optical Analysis in Microbiology]. Serpukhov; 2007. 159 p.Борисова С.В., Кузнецова Е.М., Ерохин П.С., Волох О.А. Применение нового инструментального метода для оценки функционального состояния клеток Francisella tularensis в стрессовых условиях. Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2019; 19(3):326–30.Borisova S.V., Kuznetsova E.M., Erokhin P.S., Volokh O.A. [Application of new instrumental method for the assessment of the functional state of Francisella tularensis cells under stressful conditions]. Izvestiya Saratovskogo Universiteta. Novaya Seriya: Khimiya. Biologiya. Ekologiya [Bulletin of the Saratov University. New Series: Chemistry, Biology, and Ecology]. 2019; 19(3):326–30.Волох О.А., Антонычева М.В., Авдеева Н.Г., Вахрушина И.И., Никифоров А.К. Питательная среда для глубинного культивирования туляремийного микроба. Патент РФ № 2518282, опубл. 10.06.2014 г. Бюл. № 16.Volokh O.A., Antonycheva M.V., Avdeeva N.G., Vakhrushina I.I., Nikiforov A.K. [Nutrient medium for submerged cultivation of tularemia microbe]. RF Patent No 2518282, Published on June 10, 2014. Bulletin No 16.Бибиков Д.Н., Комиссаров А.В., Волох О.А., Кузнецова Е.М., Никифоров А.К. Способ получения лиофилизата вакцины туляремийной живой. Патент РФ № 2716505, опубл. 12.03.2020 г. Бюл. № 8Bibikov D.N., Komissarov A.V., Volokh O.A., Kuznetsova E.M., Nikiforov A.K. [Method for the production of lyophilizate of live tularemia vaccine]. RF Patent No 2716505, published on March 12, 2020. Bulletin No 8.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases: Practice Guidelines]. Moscow: “Shiko” CJSC; 2013. 560 p.Волошин А.Г., Бунин В.Д., Веревкин В.В., Игнатов С.Г. Электрооптический анализ как средство контроля за внешними воздействиями на клетки. Бактериология. 2017; 2(4):46–9.Voloshin A.G., Bunin V.D., Verevkin V.V., Ignatov S.G. [Electro-optical analysis as a means of control over external effects on cells]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2017; 2(4):46–9.Унгуряну Т.Н., Гржибовский А.М. Корреляционный анализ с использованием пакета статистических программ STATA. Экология человека. 2014; 9:60–4.Unguryanu T.N., Grizhebovsky A.M. [Correlation analysis using STATA]. Ekologiya Cheloveka [Human Ecology]. 2014; 9:60–4.Angersbach A., Bunin V., Ignatov O. Electrooptical analysis of bacterial cells. In: Molecular and Colloidal Electro-Optics. Stoylov and Stoimenova (eds.) Chapter 13. London, New York: Taylor&Francis, Boca Raton; 2006. P. 307–26. DOI: 10.1201/9781420009859.ch13.Angersbach A., Bunin V., Ignatov O. Electrooptical analysis of bacterial cells. In: Molecular and Colloidal Electro-Optics. Stoylov and Stoimenova (eds.) Chapter 13. London, New York: Taylor&Francis, Boca Raton; 2006. P. 307–26. DOI: 10.1201/9781420009859.ch13.Rey L., May J.C., editor. Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. London: Informa Healthcare; 2010. 564 р.Rey L., May J.C., editor. Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. London: Informa Healthcare; 2010. 564 р.Zhivkov A.M., Gyurova A.Y. High frequency electric polarizability of bacteria E. coli: dependence on the medium ionic strength. Colloids Surf. B: Biointerfaces. 2008; 66(2):201–5. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2008.06.007.Zhivkov A.M., Gyurova A.Y. High frequency electric polarizability of bacteria E. coli: dependence on the medium ionic strength. Colloids Surf. B: Biointerfaces. 2008; 66(2):201–5. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2008.06.007.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.