microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2020-3-83-88microbe-1367Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESКачественные показатели экспериментальных бруцеллезных антигенных препаратов, предназначенных для клеточных тестов in vitroQualitative Indicators of Experimental Brucellosis Antigen Preparations Designed for Cellular Tests in vitrohttps://orcid.org/0000-0002-3564-0791КурчеваC. А.KurchevaS. A.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9366-5647КовалевД. А.KovalevD. A.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-0422-6755ПономаренкоД. Г.PonomarenkoD. G.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-9442-6966СирицаЮ. В.SiritsaYu. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-6068-6655КостюченкоМ. В.KostyuchenkoM. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-6617-9504КошкидькоА. Г.Koshkid’koA. G.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-8443-4089ЖарниковаИ. В.ZharnikovaI. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-6073-6544РакитинаЕ. Л.RakitinaE. L.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-1054-8937ЛогвиненкоО. В.LogvinenkoO. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-7698-7361ЖировА. М.ZhirovA. M.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт»РоссияStavropol Research Anti-Plague InstituteRussian Federation202019102020038388Copyright © Курчева C.А., Ковалев Д.А., Пономаренко Д.Г., Сирица Ю.В., Костюченко М.В., Кошкидько А.Г., Жарникова И.В., Ракитина Е.Л., Логвиненко О.В., Жиров А.М., 20202020Курчева C.А., Ковалев Д.А., Пономаренко Д.Г., Сирица Ю.В., Костюченко М.В., Кошкидько А.Г., Жарникова И.В., Ракитина Е.Л., Логвиненко О.В., Жиров А.М.Kurcheva S.A., Kovalev D.A., Ponomarenko D.G., Siritsa Y.V., Kostyuchenko M.V., Koshkid’ko A.G., Zharnikova I.V., Rakitina E.L., Logvinenko O.V., Zhirov A.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1367

Для разработки наиболее диагностически информативных методик постановки антиген-стимулированных клеточных тестов in vitro необходим тщательный подбор стимулирующего агента (антигена), обладающего достаточным активирующим потенциалом и обеспечивающим специфичность реакции.

Цель работы – определение качественных показателей экспериментальных серий бруцеллезных антигенных препаратов, предназначенных для клеточных тестов in vitro.

Материалы и методы

Материалы и методы. Для проведения исследований получали антигенные комплексы бруцеллезного микроба – на основе вакцинных штаммов трех эпидемически значимых видов Brucella spp. (B. abortus, B. melitensis, B. suis). Количественное определение белков экспериментальных серий полученных препаратов WsAg и PPBC проводили методом специфической флуориметрии. Исследование белкового состава препаратов проводили методом капиллярного электрофореза. Качественный состав определяли методом ионообменной жидкостной хроматографии с рефрактометрической детекцией.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В результате исследований определены физико-химические характеристики, изучены хроматографические профили и состав белковых фракций, а также проведена апробация изготовленных экспериментальных серий бруцеллезных антигенных препаратов. Анализируя охарактеризованный белковый и полисахаридный состав полученных образцов WsAg, можно сделать заключение о невозможности использования препарата WsAg для клеточных тестов, так как экспериментально доказана вероятность проявления неспецифических реакций лимфоцитов in vitro. В свою очередь, комплексный бруцеллезный антигенный препарат PPBC обладает выраженной специфической активностью и специфичностью в условиях in vitro и имеет перспективы использования при разработке методических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза и оценке фактической привитости контингентов риска после вакцинации. Полученные характеристики позволят обеспечить надлежащее качество при производстве разработанного экспериментального препарата PPBC,  предназначенного для клеточных тестов in vitro, с учетом современных правил валидации и стандартизации. 

In order to develop the most diagnostically informative methods for carrying out antigen-stimulated cellular tests in vitro a careful selection of stimulating agent (antigen) is required, possessing an adequate activating potential and providing specificity of the reaction.

Objective of the study was to identify the qualitative indicators of experimental batches of brucellosis antigen preparations designed for cellular tests in vitro.

Materials and methods

Materials and methods. Initially we produced antigen complexes of brucellosis microbe on the basis of the vaccine strains of three epidemically significant Brucella species (B. abortus, B. melitensis, B. suis). Quantitative determination of WsAg and PPBC proteins of experimental preparation series was performed applying capillary electrophoresis. Qualitative composition was assessed through ion exchange liquid chromatography with refractometric detection.

Results and discussion

Results and discussion. We have specified physical-chemical features, investigated chromatographic profiles and composition of protein fractions, as well as tried the produced experimental batches of brucellosis antigen preparations. After analyzing the defined protein and polysaccharide composition of the obtained WsAg samples, one can conclude that WsAg preparation cannot be used for cellular tests as the probability of non-specific lymphocyte reaction manifestation in vitro was experimentally proven. By contrast, complex brucellosis antigen preparation PPBC has an expressed specific activity and specificity under in vitro conditions and the prospects to be used when developing methodological approaches for laboratory diagnosis of brucellosis and assessment of de facto immunity rate in risk contingents after vaccination. The obtained parameters will allow for proper quality provision when manufacturing the developed experimental PPBC preparation designed for cellular tests in vitro, taking into account modern validation and standardization regulations. 

бруцеллезBrucella spp.антигенспецифические клеточные тесты in vitroантигенный комплексbrucellosisBrucella spp.antigen-specific cellular tests in vitroantigen complexReferencesByndloss M.X., Tsolis R.M. Brucella spp. virulence factors and immunity. Annual Review of Animal Biosciences. 2016; 4:111– 27. DOI: 10.1146/annurev-animal-021815-111326.Byndloss M.X., Tsolis R.M. Brucella spp. virulence factors and immunity. Annual Review of Animal Biosciences. 2016; 4:111–27. DOI: 10.1146/annurev-animal-021815-111326.Głowacka P., Żakowska D., Naylor K., Niemcewicz M., Bielawska-Drózd A. Brucella – virulence factors, pathogenesis and treatment. Polish Journal of Microbiology. 2018; 67(2):151–61. DOI: 10.21307/pjm-2018-029.Głowacka P., Żakowska D., Naylor K., Niemcewicz M., Bielawska-Drózd A. Brucella – virulence factors, pathogenesis and treatment. Polish Journal of Microbiology. 2018; 67(2):151–61. DOI: 10.21307/pjm-2018-029.Amjadi O., Rafiei A., Mardani M., Zafari P, Zarifian A. A review of the immunopathogenesis of Brucellosis. Infect. Dis. (Lond). 2019; 51(5):321–33. DOI: 10.1080/23744235.2019.1568545.Amjadi O., Rafiei A., Mardani M., Zafari P, Zarifian A. A review of the immunopathogenesis of Brucellosis. Infect. Dis. (Lond). 2019; 51(5):321–33. DOI: 10.1080/23744235.2019.1568545.Smith J.A. Brucella Lipopolysaccharide and pathogenicity: The core of the matter. Virulence. 2018; 9(1):379–82. DOI: 10.1080/21505594.2017.1395544.Smith J.A. Brucella Lipopolysaccharide and pathogenicity: The core of the matter. Virulence. 2018; 9(1):379–82. DOI: 10.1080/21505594.2017.1395544.Avila-Calderón E.D., Flores-Romo L., Sharon W., Donis-Maturano L., Becerril-García M.A., Arreola M.G.A., Reynoso B.A., Güemes F.S., Contreras-Rodríguez A. Dendritic cells and Brucella spp. interaction: the sentinel host and the stealthy pathogen. Folia Microbiol (Praha). 2020; 65(1):1–16. DOI: 10.1007/s12223-019-00691-6.Avila-Calderón E.D., Flores-Romo L., Sharon W., Donis-Maturano L., Becerril-García M.A., Arreola M.G.A., Reynoso B.A., Güemes F.S., Contreras-Rodríguez A. Dendritic cells and Brucella spp. interaction: the sentinel host and the stealthy pathogen. Folia Microbiol (Praha). 2020; 65(1):1–16. DOI: 10.1007/s12223-019-00691-6.Брико Н.И., Онищенко Г.Г., Покровский В.И. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство»; 2019. Т. 1. 880 с.Briko N.I., Onishchenko G.G., Pokrovsky V.I. Guidelines on epidemiology of infectious diseases [in 2 vols.]. Moscow: “Medical information Agency” Publishing house; 2019. Vol. 1. 880 p.Костюченко М.В., Пономаренко Д.Г., Ракитина Е.Л., Логвиненко О.В., Санникова И.В., Дейнека Д.А., Голубь О.Г. Перспектива оценки антигенреактивности лимфоцитов in vitro для диагностики острого бруцеллеза. Инфекция и иммунитет. 2017; 7(1):91–6. DOI: 10.15789/2220-7619-2017-1-91-96.Kostyuchenko M.V., Ponomarenko D.G., Rakitina E.L., Logvinenko O.V., Sannikova I.V., Deyneka D.A., Golub’ O.G. Prospect of assessment of lymphocyte antigen-reactivity in vitro for diagnostics of acute brucellosis. Infektsiya i Immunitet [Infection and Immunity]. 2019; 21(3):547–54. DOI: 10.15789/2220-7619-2017-1-91-96.Костюченко М.В., Ракитина Е.Л., Пономаренко Д.Г., Логвиненко О.В., Курчева С.А., Бердникова Т.В., Русанова Д.В., Куличенко А.Н. Изучение формирования клеточного поствакцинального иммунитета против бруцеллеза в лимфоцитарных тестах in vitro c использованием экспериментального антигенного комплекса. Медицинская иммунология. 2019; 21(3):547–54. DOI: 10.15789/1563-0625-2019-3-547-554.Kostyuchenko M.V., Rakitina E.L., Ponomarenko D.G., Logvinenko O.V., Kurcheva S.A., Berdnikova T.V., Rusanova D.V., Kulichenko A.N. Studying development of post-vaccinal cellular immunity against brucellosis by means of lymphocyte in vitro tests using an experimental antigenic complex. Meditsinskaya Immunologiya [Medical Immunology]. 2019; 21(3):547–54. DOI: 10.15789/1563-0625-2019-3-547-554.Пономаренко Д.Г. Новый подход к комплексной оценке иммунобиологической реактивности контингента, подлежащего вакцинации (ревакцинации) против бруцеллеза. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2015; 3:28–31.Ponomarenko D.G. A new approach to comprehensively assessing immunobiological responsiveness in a cohort to be vaccinated (revaccinated) against brucellosis Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Aktual’nye Voprosy [Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items]. 2015; 3:28–31.Budak F., Bal S.H., Tezcan G., Akalın E.H., Yılmaz A., Hız P., Oral H.B. The microRNA expression signature of CD4+ T cells in the transition of brucellosis into chronicity. PLoS One. 2018; 13(6):e0198659. DOI: 10.1371/journal.pone.0198659.Budak F., Bal S.H., Tezcan G., Akalın E.H., Yılmaz A., Hız P., Oral H.B. The microRNA expression signature of CD4+ T cells in the transition of brucellosis into chronicity. PLoS One. 2018; 13(6):e0198659. DOI: 10.1371/journal.pone.0198659.Starska K., Głowacka E., Kulig A., Lewy-Trenda I., Bryś M., Lewkowicz P. Prognostic value of the immunological phenomena and relationship with clinicopathological characteristics of the tumor – the expression of the early CD69+, CD71+ and the late CD25+, CD26+, HLA/DR+ activation markers on T CD4+ and CD8+ lymphocytes in squamous cell laryngeal carcinoma. Part II. J. Folia Histochem. Сytobiol. 2011; 49(4):593–603. DOI: 10.5603/FHC.2011.0082.Starska K., Głowacka E., Kulig A., Lewy-Trenda I., Bryś M., Lewkowicz P. Prognostic value of the immunological phenomena and relationship with clinicopathological characteristics of the tumor – the expression of the early CD69+, CD71+ and the late CD25+, CD26+, HLA/DR+ activation markers on T CD4+ and CD8+ lymphocytes in squamous cell laryngeal carcinoma. Part II. J. Folia Histochem. Сytobiol. 2011; 49(4):593–603. DOI: 10.5603/FHC.2011.0082.Shipkova M., Wieland E. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation. Clinica Chimica Acta. 2012; 413(17–18):1338–49. DOI: 10.1016/j.cca.2011.11.006.Shipkova M., Wieland E. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation. Clinica Chimica Acta. 2012; 413(17–18):1338–49. DOI: 10.1016/j.cca.2011.11.006.Shevach E.M., McHugh R.S., Piccirillo C.A., Thornton A.M. Control of T-cell activation by CD4+ CD25+ suppressor T cells. Immunol. Rev. 2001; 182:58–67. DOI: 10.1034/j.1600-065-x.2001.1820104.x.Shevach E.M., McHugh R.S., Piccirillo C.A., Thornton A.M. Control of T-cell activation by CD4+ CD25+ suppressor T cells. Immunol. Rev. 2001; 182:58–67. DOI: 10.1034/j.1600-065-x.2001.1820104.x.Moreno-Lafont M.C., López-Santiago R., Zumarán-Cuéllar E., Paredes-Cervantes V., López-Merino A., Estrada-Aguilera A., Santos-Argumedo L. Antigen-specific activation and proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes from brucellosis patients. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2002; 96(3):340–7. DOI: 10.1016/s0035-9203(02)90119-7.Moreno-Lafont M.C., López-Santiago R., Zumarán-Cuéllar E., Paredes-Cervantes V., López-Merino A., Estrada-Aguilera A., Santos-Argumedo L. Antigen-specific activation and proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes from brucellosis patients. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2002; 96(3):340–7. DOI: 10.1016/s0035-9203(02)90119-7.Coria L.M., Ibañez A.E., Pasquevich K.A., González Cobiello P.L., Frank F.M., Giambartolomei G.H., Cassataro J. Brucella abortus Omp19 recombinant protein subcutaneously co-delivered with an antigen enhances antigen-specific T helper 1 memory responses and induces protection against parasite challenge. Vaccine. 2016; 34(4):430–7. DOI: 10.1016/j.vaccine.2015.12.012.Coria L.M., Ibañez A.E., Pasquevich K.A., González Cobiello P.L., Frank F.M., Giambartolomei G.H., Cassataro J. Brucella abortus Omp19 recombinant protein subcutaneously co-delivered with an antigen enhances antigen-specific T helper 1 memory responses and induces protection against parasite challenge. Vaccine. 2016; 34(4):430–7. DOI: 10.1016/j.vaccine.2015.12.012.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.