microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-1-110-115microbe-1445Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка и апробация способа выявления РНК вируса Луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времениDevelopment and Testing of a Method for Detecting Lujo Virus RNA by Reverse Transcription and Real Time Polymerase Chain Reactionhttps://orcid.org/0000-0001-6474-3696НайденоваЕ. В.NaidenovaE. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

https://orcid.org/0000-0002-5500-0169ДедковВ. Г.DedkovV. G.

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

14 Mira St., Saint Petersburg, 197101

АгафоновД. А.AgafonovD. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

СеничкинаА. М.SenichkinaA. M.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

СафоноваМ. В.SafonovaM. V.

127490, Москва, ул. Мусоргского, 4

4, Musorgskogo St., Moscow, 127490

https://orcid.org/0000-0003-3788-3452КутыревВ. В.KutyrevV. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian FederationФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»РоссияSaint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and MicrobiologyRussian FederationФКУЗ «Противочумный центр»РоссияPlague Control CenterRussian Federation20211604202101110115Copyright © Найденова Е.В., Дедков В.Г., Агафонов Д.А., Сеничкина А.М., Сафонова М.В., Кутырев В.В., 20212021Найденова Е.В., Дедков В.Г., Агафонов Д.А., Сеничкина А.М., Сафонова М.В., Кутырев В.В.Naidenova E.V., Dedkov V.G., Agafonov D.A., Senichkina A.M., Safonova M.V., Kutyrev V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1445

Цель – разработка и оценка эффективности способа выявления РНК вируса Луйо в пробах клинического и биологического материала с помощью одношаговой ОТ-ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы

Материалы и методы. Для подбора консервативных участков генома использовали доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) последовательности вируса Луйо, выровненные с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). Для проведения ОТ-ПЦР в одном раунде использовали обратную транскриптазу и TaqF-полимеразу. Для создания положительного контрольного образца (ПКО) получали рекомбинантный штамм Escherichia coli XL1-Вlue, содержащий плазмиду pGEM-T со встроенным синтетически полученным фрагментом генома вируса. Сконструированные рекомбинантные плазмиды использовали для создания РНК-содержащего ПКО с защитной белковой оболочкой MS2-фага. Определение специфичности разработанного способа осуществляли с использованием контрольной панели РНК и ДНК 23 штаммов вирусов, относящихся к 10 семействам, чувствительности – панели биологических образцов, искусственно контаминированных ПКО. Дальнейшую апробацию проводили на базе лаборатории Российско-Гвинейского центра эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней (г. Kindia, Гвинейская Республика) на 265 сыворотках крови практически здоровых людей, 110 сыворотках крови крупного рогатого скота, 83 суспензиях клещей, 165 суспензиях органов мелких млекопитающих, собранных на территории Гвинеи.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В качестве мишени для детекции РНК вируса Луйо методом ОТ-ПЦР выбраны два консервативных фрагмента гена полимеразы. Экспериментально подобрано сочетание праймеров и зондов, установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения ПЦР, режим постановки ОТ-ПЦР, а также разработаны контрольные образцы К+, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец. Чувствительность предложенного способа составила 5·103  ГЭ/мл, специфичность – 100 %. 

The aim of the study was to develop and assess the efficacy of a method for Lujo virus RNA detection in clinical and biological samples using one-step real-time RT-PCR.

Materials and methods

Materials and methods. In order to select the conservative regions of the genome, we utilized the available in GenBank database Lujo virus sequences (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank) aligned in BioEdit 7.2.5 software package ( (IbisBiosciences, USA). To conduct one-round RTPCR, reverse transcriptase and TaqF-polimerase were used. Recombinant Escherichia coli strain, XL1-Blue, containing pGEM-T plasmid with inserted synthetically-generated fragment of the virus genome, was produced to make positive control sample (PCS). Constructed recombinant plasmids were used for creating RNA-containing PCS with protective protein shell of MS2-phage. Determination of specificity of the developed method was performed with the help of control panel of RNA and DNA of 23 viral strains related to 10 families; the sensitivity – the panel of biological samples artificially contaminated with PCS. Further testing was carried out at the premises of laboratory of the Russian-Guinean Center for Epidemiology and Prevention of Infectious Diseases (Kindia, Republic of Guinea) on 265 blood sera from practically healthy persons, 110 blood sera of cattle, 83 suspensions of ticks, and 165 suspensions of organs of small mammals collected in the territory of Guinea.

Results and discussion

Results and discussion. Two conservative polymerase gene fragments have been chosen as targets for Lujo virus RNA detection using RT-PCR. The combination of primers and probes has been experimentally selected, optimum composition of reaction mixture for PCR and mode of RT-PCR set-up established, as well as control samples C+, internal control, positive control sample developed. Sensitivity of the proposed method is 5·103  GE /ml, specificity – 100 %. 

вирус Луйогеморрагическая лихорадка ЛуйоОТ-ПЦР в реальном времениГвинейская РеспубликаLujo virusLujo hemorrhagic feverreal-time RT-PCRRepublic of GuineaАвторский коллектив выражает свою благодарность за помощь в сборе образцов клинического и биологического материала сотрудникам Исследовательского института прикладной биологии Гвинеи (г. Kindia, Гвинейская Республика) и Института медицинской ветеринарии (г. Dalaba, Гвинейская Республика).ReferencesPaweska J.T., Sewlall N.H., Ksiazek T.G., Blumberg L.H., Hale M.J., Lipkin W.I., Weyer J., Nichol S.T., Rollin P.E., McMullan L.K., Paddock C.D., Briese T., Mnyaluza J., Dinh T.H., Mukonka V., Ching P., Duse A., Richards G., de Jong G., Cohen C., Ikalafeng B., Mugero C., Asomugha C., Malotle M.M., Nteo D.M., Misiani E., Swanepoel R., Zaki S.R. Nosocomial outbreak of novel arenavirus infection, Southern Africa. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(10):1598– 602. DOI: 10.3201/eid1510.090211.Paweska J.T., Sewlall N.H., Ksiazek T.G., Blumberg L.H., Hale M.J., Lipkin W.I., Weyer J., Nichol S.T., Rollin P.E., McMullan L.K., Paddock C.D., Briese T., Mnyaluza J., Dinh T.H., Mukonka V., Ching P., Duse A., Richards G., de Jong G., Cohen C., Ikalafeng B., Mugero C., Asomugha C., Malotle M.M., Nteo D.M., Misiani E., Swanepoel R., Zaki S.R. Nosocomial outbreak of novel arenavirus infection, Southern Africa. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(10):1598– 602. DOI: 10.3201/eid1510.090211.Briese T., Paweska J.T., McMullan L.K., Hutchison S.K., Street C., Palacios G., Khristova M.L., Weyer J., Swanepoel R., Egholm M., Nichol S.T., Lipkin W.I. Genetic detection and characterization of Lujo virus, a new hemorrhagic fever-associated arenavirus from Southern Africa. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000455. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000455.Briese T., Paweska J.T., McMullan L.K., Hutchison S.K., Street C., Palacios G., Khristova M.L., Weyer J., Swanepoel R., Egholm M., Nichol S.T., Lipkin W.I. Genetic detection and characterization of Lujo virus, a new hemorrhagic fever-associated arenavirus from Southern Africa. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000455. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000455.Ishii A., Thomas Y., Moonga L., Nakamura I., Ohnuma A., Hang'ombe B.M., Takada A., Mweene A.S., Sawa H. Molecular surveillance and phylogenetic analysis of Old World arenaviruses in Zambia. J. Gen. Virol. 2012; 93(Pt 10):2247–51. DOI: 10.1099/vir.0.044099-0.Ishii A., Thomas Y., Moonga L., Nakamura I., Ohnuma A., Hang’ombe B.M., Takada A., Mweene A.S., Sawa H. Molecular surveillance and phylogenetic analysis of Old World arenaviruses in Zambia. J. Gen. Virol. 2012; 93(Pt 10):2247–51. DOI: 10.1099/vir.0.044099-0.Сизикова Т.Е., Лебедев В.Н., Сыромятникова С.И., Борисевич С.В. Геморрагическая лихорадка Луйо. Вопросы вирусологии. 2017; 62(4):149–53. DOI: 10.18821/0507-4088-2017-62-4-149-153.Sizikova T.E., Lebedev V.N., Syromyatnikova S.I., Borisevich S.V. [Lujo hemorrhagic fever]. Voprosy Virusologii [Problems of Virology]. 2017; 62(4):149–53. DOI: 10.18821/0507-4088-2017-62-4-149-153.Atkinson B., Chamberlain J., Dowall S.D., Cook N., Bruce C., Hewson R. Rapid molecular detection of Lujo virus RNA. J. Virol. Methods. 2014; 195:170–3. DOI: 10.1016/j.jviromet.2013.09.006.Atkinson B., Chamberlain J., Dowall S.D., Cook N., Bruce C., Hewson R. Rapid molecular detection of Lujo virus RNA. J. Virol. Methods. 2014; 195:170–3. DOI: 10.1016/j.jviromet.2013.09.006.Найденова Е.В., Дедков В.Г., Сафонова М.В., Сеничкина А.М., Агафонов Д.А., Захаров К.С., Щербакова С.А., Кутырев В.В. Разработка методики выявления РНК вируса Луйо с использованием полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией. В кн.: Покровский В.И., редактор. Сборник трудов Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2018». Минск: СтройМедиаПроект; 2018. С. 453–4.Naidenova E.V., Dedkov V.G., Safonova M.V., Senichkina A.M., Agafonov D.A., Zakharov K.S., Shcherbakova S.A., Kutyrev V.V. [Development of a method for detecting Lujo virus RNA using polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence detection]. In: [Pokrovsky V.I., editor. Proceedings of the International Scientific and Practical Conference “Molecular Diagnostics-2018”]. Minsk: “StroyMediaProekt”; 2018. P. 453–4.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.