microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-2-79-86microbe-1498Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСпособ определения профиля генов антибиотикорезистентности у штаммов Vibrio cholerae с помощью ПЦР в режиме реального времениMethod for Determining the Profile of Antibiotic Resistance Genes in the Vibrio cholera Strains by RT-PCRhttps://orcid.org/0000-0001-6759-1907ГладкихА. С.GladkikhA. S.

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047

angladkikh@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-9890-0960ФедотоваИ. С.FedotovaI. S.

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047

https://orcid.org/0000-0001-8481-6442МироноваЛ. В.MironovaL. V.

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»РоссияIrkutsk Anti-Plague Research Institute of Siberia and Far EastRussian Federation202121072021027986Copyright © Гладких А.С., Федотова И.С., Миронова Л.В., 20212021Гладких А.С., Федотова И.С., Миронова Л.В.Gladkikh A.S., Fedotova I.S., Mironova L.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1498

Цель работы заключалась в конструировании и опытно-экспериментальных исследованиях набора реагентов для выявления спектра генов, детерминирующих резистентность к антибактериальным препаратам у штаммов Vibrio cholerae.

Материалы и методы

Материалы и методы. В работу были взяты штаммы V. cholerae, выделенные от людей и из объектов окружающей среды во время эпидосложнений и в благополучный по холере период. Чувствительность к антимикробным препаратам оценивали диско-диффузионным методом. Полногеномное секвенирование проведено на приборе Illumina MiSeq. Профиль генов резистентности определяли на основании сравнения с базой данных ResFinder. Проведены оптимизация температурного режима, состава реакционных смесей, подбор параметров реакции, определены специфичность, чувствительность и воспроизводимость сконструированного прототипа тест-системы.

Результаты и выводы

Результаты и выводы. Для взятых в работу штаммов определен спектр устойчивости к антибиотикам и профиль генов резистентности. Для разработки мультиплексной ПЦР выбраны наиболее распространенные в популяциях V. cholerae гены, обусловливающие устойчивость к тетрациклину (tetA), стрептомицину (strA), флорфениколу/хлорамфениколу (floR) и триметоприму/сульфаметоксазолу (две формы гена дигидрофолатредуктазы: dfrA1 и dhfR), а также ген интегразы SXT-элемента (int). В реакции специфично выявляются маркеры в соответствии с геномным профилем резистентности, что коррелирует с фенотипическим проявлением устойчивости, определенным диско-диффузионным методом. Чувствительность разработанной панели праймеров и зондов для штаммов V. cholerae составила 103 –104  КОЕ/мл. Таким образом, учитывая специфичность, быстроту и простоту постановки реакции, разработанная система праймеров и зондов может быть успешно применена для предварительной оценки резистентности штаммов V. cholerae к антимикробным препаратам. 

The aim of the work was to design and carry out experimental studies of a set of reagents to identify the spectrum of genes that determine the resistance of the Vibrio cholerae strains to antibacterial drugs.

Materials and methods

Materials and methods. V. cholerae strains isolated from humans and environmental objects during epidemiological complications and the cholera-free period were included in the study. Sensitivity to antimicrobial drugs was evaluated by the disk diffusion method. Whole genome sequencing was performed on an Illumina MiSeq. The profile of resistance genes was determined based on a comparison with the ResFinder database. The temperature regime, the composition of the reaction mixtures, and the reaction parameters were optimized; the specificity, sensitivity and reproducibility of the constructed prototype test system were measured.

Results and discussion

Results and discussion. The spectrum of antibiotic resistance and the profile of resistance genes were determined for the studied strains. To develop multiplex PCR, we selected the most common in the V. cholerae populations genes, which are responsible for resistance to tetracycline (tetA), streptomycin (strA), florfenicol/ chloramphenicol (floR) and trimethoprim/sulfamethoxazole (two variants of the dihydrofolate reductase gene: dfrA1 and dhfR), as well as SXT element integrase gene (int). In the reaction, markers were specifically detected in accordance with the genomic resistance profile, which correlates with the phenotypic manifestation of resistance determined by the disco-diffusion method. The sensitivity of the developed panel of primers and probes for V. cholerae strains was 103 –104 CFU/ml. Therefore, taking into account the specificity, rapidity and simplicity of the reaction, the developed system of primers and probes can be successfully applied for a preliminary assessment of the resistance of the V. cholerae strains to antimicrobial agents. 

Vibrio choleraeгены антибиотикорезистентностиSXT-элементПЦР-тест-системаVibrio choleraeantibiotic resistance genesSXT elementPCR test systemReferencesMunita J.M., Arias C.A. Mechanisms of antibiotic resistance. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):VMBF-0016-2015. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.Munita J.M., Arias C.A. Mechanisms of antibiotic resistance. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):VMBF-0016-2015. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.Davies J., Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74(3):417–433. DOI: 10.1128/MMBR.00016-10.Davies J., Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74(3):417–433. DOI: 10.1128/MMBR.00016-10.Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H., Nisar M.A., Alvi R.F., Aslam M.A., Qamar M.U., Salamat M.K.F., Baloch Z. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug. Resist. 2018; 11:1645–1658. DOI: 10.2147/IDR.S173867.Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H., Nisar M.A., Alvi R.F., Aslam M.A., Qamar M.U., Salamat M.K.F., Baloch Z. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug. Resist. 2018; 11:1645–1658. DOI: 10.2147/IDR.S173867.Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018; 31(4):e00088-17. DOI: 10.1128/CMR.00088-17.Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018; 31(4):e00088-17. DOI: 10.1128/CMR.00088-17.Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: Understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl 1):A83A92. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.031.Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: Understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl 1):A83A92. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.031.Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: bio¬ logy and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid. 2006; 55(3):173–83. DOI: 10.1016/j.plasmid.2006.01.001.Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: bio¬ logy and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid. 2006; 55(3):173–83. DOI: 10.1016/j.plasmid.2006.01.001.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Zankari E., Hasman H., Cosentino S., Vestergaard M., Rasmussen S., Lund O., Aarestrup F.M., Larsen M.V. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67(11):2640–4. DOI: 10.1093/jac/dks261.Zankari E., Hasman H., Cosentino S., Vestergaard M., Rasmussen S., Lund O., Aarestrup F.M., Larsen M.V. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67(11):2640–4. DOI: 10.1093/jac/dks261.Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6):1547–9. DOI: 10.1093/molbev/msy096.Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6):1547–9. DOI: 10.1093/molbev/msy096.Kalendar R., Khassenov B., Ramankulov Y., Samuilova O., Ivanov K.I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis. Genomics. 2017; 109(3–4):312–9. DOI: 10.1016/j.ygeno.2017.05.005.Kalendar R., Khassenov B., Ramankulov Y., Samuilova O., Ivanov K.I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis. Genomics. 2017; 109(3–4):312–9. DOI: 10.1016/j.ygeno.2017.05.005.Spagnoletti M., Ceccarelli D., Rieux A., Fondi M., Taviani E., Fani R., Colombo M.M., Colwell R.R., Balloux F. Acquisition and evolution of SXT-R391 integrative conjugative elements in the seventh-pandemic Vibrio cholerae lineage. mBio. 2014; 5(4):e0135614. DOI: 10.1128/mBio.01356-14.Spagnoletti M., Ceccarelli D., Rieux A., Fondi M., Taviani E., Fani R., Colombo M.M., Colwell R.R., Balloux F. Acquisition and evolution of SXT-R391 integrative conjugative elements in the seventh-pandemic Vibrio cholerae lineage. mBio. 2014; 5(4):e0135614. DOI: 10.1128/mBio.01356-14.Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60(Pt 4):397–407. DOI: 10.1099/jmm.0.023051-0.Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60(Pt 4):397–407. DOI: 10.1099/jmm.0.023051-0.Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., Senapati T., Mehra S., Dey P., Desigamani A., Kumar D., Rana P., Kumar B., Maiti T.K., Sharma N.C., Bhadra R.K., Mutreja A., Nair G.B., Ramamurthy T., Das B. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116(13):6226–31. DOI: 10.1073/pnas.1900141116.Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., Senapati T., Mehra S., Dey P., Desigamani A., Kumar D., Rana P., Kumar B., Maiti T.K., Sharma N.C., Bhadra R.K., Mutreja A., Nair G.B., Ramamurthy T., Das B. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116(13):6226–31. DOI: 10.1073/pnas.1900141116.Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Плеханов Н.А., Смирнова Н.И. Способ одновременного выявления штаммов Vibrio cholerae и определения в их геноме генов лекарственной устойчивости с помощью ПЦР в режиме реального времени. Биотехнология. 2018; 34(2):70–9. DOI: 10.21519/0234-27582018-34-2-70-79.Kritsky A.A., Cheldyshova N.B., Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Smirnova N.I. [A method for the simultaneous detection of Vibrio cholerae strains and determination of drug resistance genes in their genome using real-time PCR]. Biotekhnologiya. [Biotechnology]. 2018; 34(2):70–9. DOI: 10.21519/0234-2758-2018-34-2-70-79.Gladkikh A.S., Feranchuk S.I., Ponomareva A.S., Bochalgin N.O., Mironova L.V. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae El Tor strains isolated during cholera complications in Siberia and the Far East of Russia. Infect. Genet. Evol. 2020; 78:104096. DOI: 10.1016/j.meegid.2019.104096.Gladkikh A.S., Feranchuk S.I., Ponomareva A.S., Bochalgin N.O., Mironova L.V. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae El Tor strains isolated during cholera complications in Siberia and the Far East of Russia. Infect. Genet. Evol. 2020; 78:104096. DOI: 10.1016/j.meegid.2019.104096.Wang R., Yu D., Yue J., Kan B. Variations in SXT elements in epidemic Vibrio cholerae O1 El Tor strains in China. Sci. Rep. 2016; 6:22733. DOI: 10.1038/srep22733.Wang R., Yu D., Yue J., Kan B. Variations in SXT elements in epidemic Vibrio cholerae O1 El Tor strains in China. Sci. Rep. 2016; 6:22733. DOI: 10.1038/srep22733.Osman K.M., Kappell A.D., Elhadidy M., ElMougy F., Abd El-Ghany W.A., Orabi A., Mubarak A.S., Dawoud T.M., Hemeg H.A., Moussa I.M.I., Hessain A.M., Yousef H.M.Y. Poultry hatcheries as potential reservoirs for antimicrobial-resistant Escherichia coli: A risk to public health and food safety. Sci. Rep. 2018; 8(1):5859. DOI: 10.1038/s41598-018-23962-7.Osman K.M., Kappell A.D., Elhadidy M., ElMougy F., Abd El-Ghany W.A., Orabi A., Mubarak A.S., Dawoud T.M., Hemeg H.A., Moussa I.M.I., Hessain A.M., Yousef H.M.Y. Poultry hatcheries as potential reservoirs for antimicrobial-resistant Escherichia coli: A risk to public health and food safety. Sci. Rep. 2018; 8(1):5859. DOI: 10.1038/s41598-018-23962-7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.