microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-3-83-88microbe-1551Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПолучение и характеристика гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типовObtaining and Characterization of Hybridomas Producing Monoclonal Antibodies to Shiga-Like Toxins of I and II Typeshttps://orcid.org/0000-0002-5429-6295КуклинаГ. В.KuklinaG. V.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-2881-4730ИпатовС. С.IpatovS. S.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-8277-3573ПеченкинД. В.PechenkinD. V.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

23527@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3133-1921ЕремкинА. В.EremkinA. V.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-0277-2226КытмановА. А.KytmanovA. A.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-9171-1603ДубровинМ. Ю.DubrovinM. Yu.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-5164-3645ГоршковА. С.GorshkovA. S.

Российская Федерация, Киров

Kirov, Russian Federation

Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияAffiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution “48th Central Research Institute” of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation202123102021038388Copyright © Куклина Г.В., Ипатов С.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Дубровин М.Ю., Горшков А.С., 20212021Куклина Г.В., Ипатов С.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Дубровин М.Ю., Горшков А.С.Kuklina G.V., Ipatov S.S., Pechenkin D.V., Eremkin A.V., Kytmanov A.A., Dubrovin M.Y., Gorshkov A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1551

Цель – получить и охарактеризовать гибридомы-продуценты моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов.

Материалы и методы

Материалы и методы. В работе использованы препараты шигаподобных токсинов I и II типов, полученные в филиале ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров); мыши линии BALB/c; клетки миеломы SP2/0-Ag14. Гибридизацию спленоцитов иммунных мышей и миеломных клеток проводили по методике G. Kohler и C. Milstein в модификации De St. Fazekas и D. Scheidegger с использованием 50 % полиэтиленгликоля. Гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела, клонировали методом лимитирующих разведений. Изучение ростовых и секреторных свойств гибридом проводили при культивировании in vitro и in vivo. Специфическую активность иммунных сывороток, культуральных и асцитических жидкостей гибридом исследовали методом непрямого иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Получена панель из 8 гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Гибридомы характеризуются стабильностью пролиферативной и антителопродуцирующей активности на протяжении десяти пассажей in vitro и трех пассажей in vivo (срок наблюдения). Полученные моноклональные антитела могут быть использованы для детекции иммуноферментным методом шигаподобных токсинов I и II типов. При этом минимальная выявляемая концентрация искомых аналитов в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа составила 1 нг/мл. Показана возможность выявления шигаподобных токсинов без типовой дифференциации при использовании в иммуноферментном анализе полирецепторной смеси моноклональных антител для сенсибилизации планшета и полиспецифичной смеси иммунопероксидазных конъюгатов.

Objective – obtaining and characterization of hybrid cell lines producing monoclonal antibodies against I and II types of shiga-like toxins.

Materials and methods

Materials and methods. Shiga-like toxins obtained in “48thCentral Research Institute” of Ministry of Defense of Russian Federation (Kirov), BALB/c mice, myeloma cells SP2/0-Ag14 were used in research. Immune splenocytes and SP2/0-Ag14 myeloma cells were fused according to G. Kohler and C. Milstein method in De St. Fazekas and D. Scheidegger modifcation using 50 % polyethylene glycol. Hybrid cell lines producing specifc monoclonal antibodies were cloned by limited dilutions. Hybridomas growth and producing properties were studied in vitro and in vivo. Specifc activity of immune sera, culture and ascitic fluids were studied by indirect ELISA. Monoclonal antibodies from ascitic fluids were precipitated by saturated ammonium sulfate, followed by ion exchange chromatography

Results and discussion

Results and discussion. 8 hybridomas producing monoclonal antibodies against I and II types shiga-like toxins were obtained. Hybridomas are characterized by stable proliferation and antibody-producing activity during 10 passages in vitro and 3 passages in vivo (observation period). Obtained monoclonal antibodies can be used for ELISA detection of I and II types shiga-like toxins. Minimum detectable concentration of shiga-like toxins in sandwich ELISA is 1 ng/ml. The possibility of detecting shiga-like toxins without typical differentiation was shown when using in the enzyme immunoassay a polyreceptor mixture of monoclonal antibodies for sensitizing the plate and a polyspecifc mixture of immunoperoxidase conjugates.

шигаподобные токсинымоноклональные антителаиммуноферментный анализshiga-like toxinsmonoclonal antibodiesand enzyme linked immunosorbent assayReferencesМelton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx) classifcation, structure, and function. Microbiol. Spectr. 2014; 2(4):EHEC-0024-2013. DOI: 10.1128/microbiolspec.EHEC-0024-2013.Мelton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx) classifcation, structure, and function. Microbiol. Spectr. 2014; 2(4):EHEC-0024-2013. DOI: 10.1128/microbiolspec.EHEC-0024-2013.Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 90(20):9581–5. DOI: 0.1073/pnas.90.20.9581.Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 90(20):9581–5. DOI: 0.1073/pnas.90.20.9581.Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 2007; 85(13):E45–E62. DOI: 10.2527/jas.2006-508.Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 2007; 85(13):E45–E62. DOI: 10.2527/jas.2006-508.Paletta A.C.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxinproducing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2020; 77(4):612–20. DOI: 10.1007/s00284-019-01842-1.Paletta A.C.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxinproducing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2020; 77(4):612–20. DOI: 10.1007/s00284-019-01842-1.Taylor С.М. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23(9):1425–31. DOI: 10.1007/s00467-008-0820-3.Taylor С.М. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23(9):1425–31. DOI: 10.1007/s00467-008-0820-3.Joseph A., Cointe A., Kurkdjian P.М., Rafat C., Hertig A. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: а narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12(2):67. DOI: 10.3390/toxins2020067.Joseph A., Cointe A., Kurkdjian P.М., Rafat C., Hertig A. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: а narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12(2):67. DOI: 10.3390/toxins12020067.E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. [Электронный ресурс]. URL: www.efsa.europa.eu/en/press/news/120711 (дата обращения 10.07.2020).E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. (Cited 10 Jul 2020). [Internet]. Available from: www.efsa.europa.eu/en/press/news/120711.Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Баннов В.А., Карцев Н.Н., Борзенков В.Н., Фурсова Н.К., Шемякин И.Г., Богун А.Г., Кисличкина А.А., Попова А.В., Мякинина В.П., Теймуразов М.Г., Полосенко О.В., Кафтырева Л.А., Макарова М.А., Матвеева З.Н., Гречанинова Т.А., Григорьева Н.С., Кича Е.В., Забалуева Г.В., Кутасова Т.Б., Коржаев Ю.Н., Башкетова Н.С., Бушманова О.Н., Сталевская А.В., Чхинджерия И.Г., Жебрун А.Б. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia сoli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник РАМН. 2015; 1:70–81. DOI: 10.15690/vramn.v70i1.1234.Onishenko G., Dyatlov I., Svetoch N., Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Kartsev N.N., Borzenkov V.N., Fursova N.K., Shemyakin I.G., Bogun A.G., Kislichkina A.A., Popova A.V., Myakinina V.P., Teimurazov M.G., Polosenko O.V., Kaftyreva L.A., Makarova M.A., Matveeva Z.N., Grechaninova T.A., Grigor’eva N.S., Kicha E.V., Zabalueva G.V., Kutasova T.B., Korzhaev Yu.N., Bashketova N.S., Bushmanova O.N., Stalevskaya A.V., Chkhinzheria I.G., Zhebrun A.B. [Molecular genetic characteristics of shiga-toxins released during a food outbreak in St. Petersburg in 2013]. Vestnik Rossiiskoj Akademii Meditsinskikh Nauk [Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2015; 1:70–81. DOI: 10.15690/vramn.v70i1.1234.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265–75.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265–75.De StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1-2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.De StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1-2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefned specifcity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefned specifcity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы: Кн. 2: пер. с англ. М.: Мир; 1991. 384 с.Ketty D, editor. [Antibodies. Methods: Book 2. Translated from English]. Moscow: “Mir”; 1991. Vol. 2. 384 p.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.