microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-3-89-97microbe-1552Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОценка эффективности детекции генетических детерминант Vibrio cholerae в системе мониторинга вибриофлоры водных объектовAssessing the Efciency of Detection of Vibrio cholerae Genetic Determinants Through Waterbody Vibrioflora Monitoring Systemhttps://orcid.org/0000-0001-8481-6442МироноваЛ. В.MironovaL. V.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

adm@chumin.irkutsk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0674-6159ПономареваА. С.PonomarevaA. S.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-8358-2880БасовЕ. А.BasovE. A.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-9890-0960ФедотоваИ. С.FedotovaI. S.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

ХунхееваЖ. Ю.KhunkheevaZh. Yu.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-1167-7864ФортунатоваА. В.FortunatovaA. V.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-3053-6514БочалгинН. О.BochalginN. O.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-6759-1907ГладкихА. С.GladkikhA. S.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

УрбановичЛ. Я.UrbanovichL. Ya.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-4201-5828БалахоновС. В.BalakhonovS. V.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»РоссияIrkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far EastRussian Federation202123102021038997Copyright © Миронова Л.В., Пономарева А.С., Басов Е.А., Федотова И.С., Хунхеева Ж.Ю., Фортунатова А.В., Бочалгин Н.О., Гладких А.С., Урбанович Л.Я., Балахонов С.В., 20212021Миронова Л.В., Пономарева А.С., Басов Е.А., Федотова И.С., Хунхеева Ж.Ю., Фортунатова А.В., Бочалгин Н.О., Гладких А.С., Урбанович Л.Я., Балахонов С.В.Mironova L.V., Ponomareva A.S., Basov E.A., Fedotova I.S., Khunkheeva Z.Y., Fortunatova A.V., Bochalgin N.O., Gladkikh A.S., Urbanovich L.Y., Balakhonov S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1552

Цель – оценка эффективности применения ПЦР-скрининга генетических детерминант Vibrio cholerae в пробах из поверхностных водоемов для оптимизации системы микробиологического мониторинга холеры.

Материалы и методы

Материалы и методы. Исследование проводилось в рамках мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов Иркутска. Дизайн исследования предусматривал: 1) ПЦР-скрининг генетических детерминант V. cholerae в обогащенных на питательных средах (1 % пептонная вода) пробах из поверхностных водоемов в период мониторинга (824 пробы); 2) изучение динамики накопления ДНК V. cholerae при исследовании в ПЦР проб из поверхностных водоемов в процессе культивирования на средах обогащения (16 проб в динамике); 3) экспериментальное исследование детектируемых концентраций холерного вибриона в пробах из поверхностных водоемов. Проводилась индикация видоспецифических (hlyA, toxR) и серогруппоспецифических (wbeT, wbfR) детерминант V. cholerae в ПЦР c гибридизационно-флуоресцентной и электрофоретической детекцией.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. На первом этапе установлено, что удельный вес положительных по результатам ПЦР-скрининга проб (33,9 %) превысил процент положительных проб при бактериологическом исследовании (19,3 %) (t=6,6; p<0,01). При оценке динамики накопления ДНК зарегистрировано снижение порогового цикла (Ct) в 1,2–5,2 раза, свидетельствующее о нарастании концентрации холерного вибриона и доказывающее выявление при ПЦР-скрининге генетических детерминант жизнеспособных форм микроорганизма. Расширенное исследование ПЦР-положительных бактериологически отрицательных проб позволило дополнительно выделить четыре культуры V. cholerae. Однако в эксперименте с искусственно контаминированными холерным вибрионом образцами воды, в отличие от анализа обогащенных нативных проб, не выявлено различий чувствительности ПЦР-скрининга и бактериологического анализа, что может быть обусловлено особенностями метаболизма и адаптации микроорганизма в разных условиях среды. Результаты комплексного исследования свидетельствуют об эпидемиологической эффективности ПЦР-скрининга, что дает основание рекомендовать его применение в лабораториях федерального, регионального и территориального уровней при мониторинговых исследованиях вибриофлоры проб из объектов окружающей среды после их предварительного обогащения на жидких питательных средах.

Objective of the study was to assess the effectiveness of PCR screening of Vibrio cholerae genetic determinants in samples from surface water reservoirs for optimization of the cholera microbiological monitoring system.

Materials and methods

Materials and methods. The study was carried out as a part of the vibrioflora monitoring in surface water bodies in Irkutsk city. The study design included: 1) PCR screening of V. cholerae genetic determinants in nutrient-enriched (1 % peptone water) samples from surface water reservoirs during the monitoring period (824 samples); 2) studying of the V. cholerae DNA accumulation dynamics applying PCR assay of the samples from surface water reservoirs during cultivation on the enriched media (16 samples in dynamics); 3) experimental study of the detected V. cholerae concentrations in samples from surface water reservoirs. Species-specifc (hlyA, toxR) and serogroup-specifc (wbeT, wbfR) V. cholerae determinants were indicated in PCR with hybridization-fluorescent and electrophoretic detection.

Results and discussion

Results and discussion. At the frst stage it was found that the proportion of the positive samples through PCR screening (33.9 %) exceeded the percentage of the positive samples in bacteriological examination (19.3 %) (t=6.6; p<0,01). In the assessment of DNA accumulation dynamics, a decrease in the threshold cycle (Ct) by 1.2–5.2 times was recorded, indicating an increase in the V. cholerae concentration and proving the detection of genetic determinants of viable forms during PCR screening. An extended study of PCR-positive but bacteriologically negative samples made it possible to additionally isolate 4 V. cholerae cultures. However, there were no differences in the sensitivity of PCR screening and bacteriological analysis in the experiment with water samples artifcially contaminated with V. cholerae unlike the analysis of the enriched native samples. It can be determined by the metabolism and adaptation peculiarities of the microorganism in different environmental conditions. The results of the integrated study indicate the epidemiological effectiveness of PCR screening which gives grounds to recommend its application in monitoring studies of vibrioflora from environment after preliminary enrichment on liquid nutrient media in the work of federal, territorial, and regional laboratories.

Vibrio choleraeэпидемиологический надзормониторингповерхностные водоемымолекулярно-генетический анализПЦР-скринингVibrio choleraeepidemiological surveillancemonitoringsurface water bodiesmolecular-genetic analysisPCR screeningReferencesОнищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Маслов Д.В., Вершкова Т.И., Урбанович Л.Я., Алленов А.В., Мурначев Г.П., Гарковенко Л.Е., Воронок В.М. Холера на Дальнем Востоке России. Сообщение 1. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эль Тор в г. Владивосток. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 5:26–31.Onishchenko G.G., Maramovich A.S., Golubinsky E.P., Maslov D.V., Vershkova T.I., Urbanovich L.Ya., Allenov A.V., Murnachev G.P., Garkovenko L.E., Voronok V.M. [Cholera in the Russian Far East. Communication 1. Epidemiological characteristics of the El Tor cholera outbreak in Vladivostok]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2000; 5:26–31.Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Папиренко Е.В., Ганин В.С., Бурый В.Л., Морозова И.В., Мартынова Т.М. Холера на Дальнем Востоке России. Сообщение 2. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эль Тор в г. Южно-Сахалинск. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 5:31–5.Onishchenko G.G., Maramovich A.S., Golubinsky E.P., Papirenko E.V., Ganin V.S., Bury V.L., Morozova I.V., Martynova T.M. [Cholera in the Russian Far East. Communication 2. Epidemiological characteristics of the El Tor cholera outbreak in Yuzhno-Sakhalinsk]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2000; 5:31–5.Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Мазрухо Б.Л., Подосинникова Л.С., Кудрякова Т.А., Москвитина Э.А., Водопьянов С.О., Рыжко И.В., Казакова Е.С., Шарова И.Н., Плотникова Е.А., Давыдова Н.А., Абрамова Е.Г., Королев Ю.С., Шестиалтынова И.С., Шарифулина Д.М., Куряева Н.Ю., Юмангулова Е.Ф., Чернышева А.В., Бугоркова Т.В., Русакова Т.Г., Масленикова А.Л., Милова М.В., Захарова Л.И., Билалов Т.Г., Шутько А.Г., Качкина Г.В. Характеристика холерных вибрионов Эль Тор, выделенных в г. Казань в 2001 г. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002; 2:3–6.Onishchenko G.G., Lomov Yu.M., Mishan’kin B.N., Mazrukho B.L., Podosinnikova L.S., Kudryakova T.A., Moskvitina E.A., Vodop’yanov S.O., Ryzhko I.V., Kazakova E.S., Sharova I.N., Plotnikova E.A., Davydova N.A., Abramova E.G., Korolev Yu.S., Shestialtynova I.S., Sharifulina D.M., Kuryaeva N.Yu., Yumangulova E.F., Chernysheva A.V., Bugorkova T.V., Rusakova T.G., Maslenikova A.L., Milova M.V., Zakharova L.I., Bilalov T.G., Shut’ko A.G., Kachkina G.V. [Characteristics of El Tor cholera vibrios isolated in Kazan in 2001]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2002; 2:3–6.Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я. Случай холеры в Челябинске. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002; 2:53–4.Ratnikova L.I., Kuz’mina N.Ya. [Cholera case in Chelyabinsk]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2002; 2:53–4.Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Водяницкая С.Ю., Прометной В.И., Монахова Е.В., Водопьянов C.O., Телесманич Н.Р., Дудина Н.А. Холера, обусловленная V. cholerae O1 ctxАВ-tcpA+. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; 1:23–9.Onishchenko G.G., Lomov Yu.M., Moskvitina E.A., Podosinnikova L.S., Vodyanitskaya S.Yu., Prometnoy V.I., Monakhova E.V., Vodop’yanov C.O., Telesmanich N.R., Dudina N.A. [Cholera caused by V. cholerae O1 ctxAB-tcpA+]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2007; 1:23–9.Luo Y., Octavia S., Jin D., Ye J., Miao Z., Jiang T., Xia S., Lan R. US Gulf-like toxigenic O1 Vibrio cholerae causing sporadic cholera outbreaks in China. J. Infect. 2016; 72(5):564–72. DOI: 10.1016/j.jinf.2016.02.005.Luo Y., Octavia S., Jin D., Ye J., Miao Z., Jiang T., Xia S., Lan R. US Gulf-like toxigenic O1 Vibrio cholerae causing sporadic cholera outbreaks in China. J. Infect. 2016; 72(5):564–72. DOI: 10.1016/j.jinf.2016.02.005.Wang H., Yang C., Sun Z., Zheng W., Zhang W., Yu H., Wu Y., Didelot X., Yang R., Pan J., Cui Y. Genomic epidemiology of Vibrio cholerae reveals the regional and global spread of two epidemic nontoxigenic lineages. PLoS Negl. Trop. Dis. 2020; 14(2):e0008046. DOI: 10.1371/journal.pntd.0008046.Wang H., Yang C., Sun Z., Zheng W., Zhang W., Yu H., Wu Y., Didelot X., Yang R., Pan J., Cui Y. Genomic epidemiology of Vibrio cholerae reveals the regional and global spread of two epidemic nontoxigenic lineages. PLoS Negl. Trop. Dis. 2020; 14(2):e0008046. DOI: 10.1371/journal.pntd.0008046.Монахова Е.В., Архангельская И.В. Холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп в этиологии острых кишечных инфекций: современная ситуация в России и в мире. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 2:14–23. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-14-23.Monakhova E.V., Arkhangel’skaya I.V. [Cholera vibrios of nonO1/nonO139 serogroups in etiology of acute intestinal infections: current situation in Russia and around the world]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (2):14–23. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-14-23.Кругликов В.Д., Левченко Д.А., Титова С.В., Москвитина Э.А., Архангельская И.В., Гаевская Н.Е., Ежова М.И. Холерные вибрионы в водоемах Российской Федерации. Гигиена и санитария. 2019; 98(4):393–9. DOI: 10.18821/0016-9900-2019-98-4-393-399.Kruglikov V.D., Levchenko D.A., Titova S.V., Moskvitina E.A., Arkhangel’skaya I.V., Gaevskaya N.E., Ezhova M.I. [Cholera vibrios in the water bodies of the Russian Federation]. Gigiena i Sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2019; 98(4):393–9. DOI: 10.18821 / 0016-9900-2019-98-4-393-399.Онищенко Г.Г., Попова А.Ю., Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Щербакова С.А., Москвитина Э.А., Титова С.В. Актуальные проблемы эпидемиологического надзора, лабораторной диагностики и профилактики холеры в Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 1:89–101. DOI: 10.36233/0372-9311-2016-1-89-101.Onischenko G.G., Popova A.Yu., Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Scherbakova S.A., Moskvitina E.A., Titova S.V. [Actual problems of epidemiologic control, laboratory diagnostics and prophylaxis of cholera in the Russian Federation]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2016; 1:89–101. DOI: 10.36233/0372-9311-2016-1-89-101.Шарова И.Н., Казакова Е.С., Портенко С.А., Красовская Т.Ю., Осина Н.А., Куклев В.Е., Карнаухов И.Г., Щербакова С.А., Топорков А.В., Чеснокова М.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Совершенствование и стандартизация лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 2:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-2-46-48.Sharova I.N., Kazakova E.S., Portenko S.A., Krasovskaya T.Yu., Osina N.A., Kuklev V.E., Karnaukhov I.G., Shcherbakova S.A., Toporkov A.V., Chesnokova M.V., Kulichenko A.N., Kutyrev V.V. [Improvement and standardization of laboratory diagnostics procedures as concerns particularly dangerous, “emerging”, and “reemerging” infectious diseases]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; (2):46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-2-46-48.Онищенко Г.Г., Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Мельникова А.А. О мерах по совершенствованию эпидемиологического надзора в части индикации возбудителей инфекционных заболеваний. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013; 2:4–13.Onishchenko G.G., Ezhlova E.B., Demina Yu.V., Mel’nikova A.A. [On measures to improve epidemiological surveillance in terms of indication of pathogens of infectious diseases]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Aktual’nye Voprosy [Epidemiology and Infectious Diseases. Topical Issues]. 2013; 2:4–13.Ramamurthy T., Das B., Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Sack D.A. Diagnostic techniques for rapid detection of Vibrio cholerae O1/O139. Vaccine. 2020; 38(1):A73–A82. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.07.099.Ramamurthy T., Das B., Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Sack D.A. Diagnostic techniques for rapid detection of Vibrio cholerae O1/O139. Vaccine. 2020; 38(1):A73–A82. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.07.099.Миронова Л.В., Басов Е.А., Афанасьев М.В., Хунхеева Ж.Ю., Миткеева С.К., Ганин В.С., Урбанович Л.Я., Куликалова Е.С., Гольдапель Э.Г., Балахонов С.В. MALDI-ToF массспектрометрический анализ с молекулярно-генетической идентификацией Vibrio spp. в системе мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 19(6):27–36. DOI: 10.17816/EID40838.Mironova L.V., Basov E.A., Afanas’ev M.V., Khunkheeva Zh.Yu., Mitkeeva S.K., Ganin V.S., Urbanovich L.Ya., Kulikalova E.S., Gol’dapel E. G., Balakhonov S.V. [MALDI-ToF mass spectrometric analysis with molecular-genetic identifcation of Vibrio spp. in the system of monitoring over vibrioflora of surface water bodies]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2014; 19(6):27–36. DOI: 10.17816/EID40838.Brenzinger S., van der Aart L.T., van Wezel G.P., Lacroix J.M., Glatter T., Briegel A. Structural and proteomic changes in viable but non-culturable Vibrio cholerae. Front Microbiol. 2019; 10:793. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00793.Brenzinger S., van der Aart L.T., van Wezel G.P., Lacroix J.M., Glatter T., Briegel A. Structural and proteomic changes in viable but non-culturable Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2019; 10:793. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00793.Jubair M., Morris J.G. Jr., Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel “persister” phenotype. PLoS One. 2012; 7(9):e45187. DOI: 10.1371/journal.pone.0045187.Jubair M., Morris J.G. Jr., Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel “persister” phenotype. PLoS One. 2012; 7(9):e45187. DOI: 10.1371/journal.pone.0045187.Conner J.G., Teschler J.K., Jones C.J., Yildiz F.H. Staying alive: Vibrio cholerae’s cycle of environmental survival, transmission, and dissemination. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015.Conner J.G., Teschler J.K., Jones C.J., Yildiz F.H. Staying alive: Vibrio cholerae’s cycle of environmental survival, transmission, and dissemination. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015.Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonela typhimurium: феномен и генетический контроль. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997; 4:35–41.Romanova Yu.M., Alekseeva N.V., Gintsburg A.L. [Noncultivated state in pathogenic bacteria in the Salmonela typhimurium model: phenomenon and genetic control]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1997; 4:35–41.Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2013; 4:375. DOI: 10.3389/fmicb.2013.00375.Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2013; 4:375. DOI: 10.3389/fmicb.2013.00375.Меньшикова Е.А., Архангельская И.В., Левченко Д.А., Курбатова Е.М., Кругликов В.Д., Титова С.В. Влияние температурных флуктуаций воды поверхностных водоемов города Ростова-на-Дону на циркуляцию холерных вибрионов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2018; 14(4):14–20.Men’shikova E.A., Arkhangel’skaya I.V., Levchenko D.A., Kurbatova E.M., Kruglikov V.D., Titova S.V. [Effect of temperature fluctuations in surface water bodies of the Rostov-on-Don city on the circulation of Vibrio cholerae]. [Bulletin of Biotechnology and Physicochemical Biology named after Yu.A. Ovchinnikov]. 2018; 14(4):14–20.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.