microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-3-134-140microbe-1558Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESБиологические свойства и генетическая характеристика штаммов Francisella tularensis, изолированных на территории Ростовской области в 2020 г.Biological Properties and Genetic Characteristics of Francisella tularensis Strains Isolated in the Territory of the Rostov Region in 2020https://orcid.org/0000-0002-4091-649XЦимбалистоваМ. В.TsimbalistovaM. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-1835-1496СорокинВ. М.SorokinV. M.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-7772-9276АроноваН. В.AronovaN. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-4010-2138АнисимоваА. С.AnisimovaA. S.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-1876-5397ПичуринаН. Л.PichurinaN. L.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-1525-5693ПасюковаН. И.PasyukovaN. I.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-0008-4705СелянскаяН. А.SelyanskayaN. A.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-4336-0439ВодопьяновС. О.Vodop’yanovS. O.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-9056-3231ВодопьяновА. С.Vodop’yanovA. S.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-7178-8021ПисановР. В.PisanovR. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-8287-4294ПавловичН. В.PavlovichN. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

info@tularemia.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0840-4638КовалевЕ. В.KovalevE. V.

Российская Федерация, 344019, Ростов-на-Дону, ул. 18-я Линия, 7А

7A, 18th Liniya St., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344019

https://orcid.org/0000-0003-0550-2221НосковА. К.NoskovA. K.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gorkogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»РоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian FederationУправление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Ростовской областиРоссияRospotrebnadzor Administration in the Rostov RegionRussian Federation20212310202103134140Copyright © Цимбалистова М.В., Сорокин В.М., Аронова Н.В., Анисимова А.С., Пичурина Н.Л., Пасюкова Н.И., Селянская Н.А., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Павлович Н.В., Ковалев Е.В., Носков А.К., 20212021Цимбалистова М.В., Сорокин В.М., Аронова Н.В., Анисимова А.С., Пичурина Н.Л., Пасюкова Н.И., Селянская Н.А., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Павлович Н.В., Ковалев Е.В., Носков А.К.Tsimbalistova M.V., Sorokin V.M., Aronova N.V., Anisimova A.S., Pichurina N.L., Pasyukova N.I., Selyanskaya N.A., Vodop’yanov S.O., Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Pavlovich N.V., Kovalev E.V., Noskov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1558

Цель работы – изучение биологических свойств и генетических характеристик штаммов возбудителя туляремии, изолированных в природных очагах Ростовской области в 2020 г.

Материалы и методы

Материалы и методы. Полевой материал исследовали серологическим, бактериологическим, биологическим и молекулярно-генетическими методами. Получение белковых спектров исследуемых культур методом MALDI-TOF MS проводили с использованием масс-спектрометра Autoflex speed III Bruker Daltonics и программного обеспечения Flex Control, идентификацию штаммов – с помощью программы Biotyper. Генетические характеристики штаммов определяли методами VNTR- и INDEL-типирования и SNP-анализом.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. При мониторинге природных очагов туляремии от мышевидных грызунов с помощью биологической пробы выделены шесть штаммов возбудителя туляремии. Показано, что по своим биологическим свойствам, а также в соответствии с данными ПЦР-анализа и INDEL-типирования по каноническим маркерам все штаммы являются типичными представителями вида Francisella tularensis subsp. holarctica biovar EryR. При VNTR-типировании по шести генетическим локусам установлено, что штаммы относятся к четырем индивидуальным генотипам. Штамм, выделенный в 2020 г. в природном очаге Сальского района, оказался идентичен штамму, выделенному в этом же районе в 1989 г. На основе полногеномного секвенирования двух штаммов обнаружено, что по изучаемому набору SNP-маркеров они наиболее близки культурам, изолированным в Турции (2009, 2012 гг.) и в Ханты-Мансийске (2013 г.). Таким образом, установлено, что в природных очагах Ростовской области в течение длительного времени могут циркулировать как идентичные (или близкородственные) клоны возбудителя туляремии, так и появляться новые штаммы с уникальными генотипами, ранее не описанными для Ростовской области.

Objective of the study was to investigate biological properties and genetic characteristics of tularemia agent strains isolated from natural foci of the Rostov Region in 2020.

Materials and methods

Materials and methods. Field material from natural foci of the Rostov Region was examined by serological, bacteriological, biological, and molecular-genetic methods. Cultural-morphological, biochemical, antigenic and pathogenic properties of isolated cultures were studied. Protein profles were obtained through MALDI-TOF MS using mass spectrometer Autoflex speed III Bruker Daltonics and Flex Control of Biotyper software. The genetic characteristics of the strains were determined by VNTR and INDEL typing and SNP analysis.

Results and discussion

Results and discussion. Six strains of tularemia pathogen were isolated from mouse-like rodents using biological method. The investigation of their biological features and data of PCR analysis and INDEL typing with canonical markers showed that all strains are typical representatives of the Francisella tularensis subsp. holarctica biovar EryR. VNTR typing by six genetic loci revealed that all strains belong to four individual genotypes. The strain isolated in 2020 in the Salsky district was identical to the strain which was isolated in the same area in 1989. Based on the whole genome sequencing of two strains, we established that they are closest to the cultures isolated in Turkey (2009, 2012) and Khanty-Mansiysk (2013) by the studied set of SNP markers. Thus, we found that both identical (or closely related) clones of the tularemia agent and new strains with unique genotypes which previously were not described for the Rostov Region can circulate in natural foci of this region for a long period of time.

Francisella tularensisвыделение штаммовбиологические свойстваINDEL-типированиеVNTR-типированиеSNP-типированиеFrancisella tularensisisolation of strainsbiological propertiesINDEL-typingVNTR-typingSNP-typingReferencesМещерякова И.С., Добровольский А.А., Демидова Т.Н., Кормилицына М.И., Михайлова Т.В. Трансмиссивная эпидемическая вспышка туляремии в г. Ханты-Мансийске в 2013 году. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 5(78):14–20.Mesheryakova I.S., Dobrovolsky A.A., Demidova T.N., Kormilitsyna M.I., Mikhailova T.V. Vector-borne epidemic outbreak of tularemia in the town of Khanty-Mansiysk in 2013. Epidemiologiya i Vaktsinoproflaktika. [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2014; 5(78):14–20.Мокриевич А.Н., Кравченко Т.Б., Фирстова В.В., Титарева Г.М., Дятлов И.А., Тимофеев В.С. Туляремия: состояние проблемы и методы исследования. Оболенск; М.: Династия; 2019. 263 с.Mokrievich A.N., Kravchenko T.B., Firstova V.V., Titareva G.M., Dyatlov I.A., Timofeev V.S. Tularemia: State of the Problem and Research Methods. Obolensk; M .: “Dynasty”; 2019. 263 p.Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Пакскина Н.Д., Холин А.В., Мазепа А.В., Куликалова Е.С., Косилко С.А., Бирковская Ю.А., Транквилевский Д.В., Храмов М.В., Дятлов И.А. Эпидемическая активность природных очагов туляремии на территории Российской Федерации в 2018 г. и прогноз ситуации на 2019 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; 1:32–41. DOI: 10.21055/0370-1069-2019-1-32-41.Kudryavtseva T.Yu., Popov V.P., Mokrievich A.N., Pakskina N.D., Kholin A.V., Mazepa A.V., Kulikalova E.S., Kosilko S.A., Birkovskaya Yu. A., Trankvilevsky D.V., Khramov M.V., Dyatlov I.A. Epidemic activity of natural tularemia foci in the territory of the Russian Federation in 2018 and forecast of the situation for 2019. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2019; 1:32–41. DOI: 10.21055/0370-1069-2019-1-32-41.Ковалев Е.В., Карпущенко Г.В., Швагер М.М., Полонский А.В., Сидельников В.В., Гончаров А.Ю., Половинка Н.В. Особенности распространения туляремийной инфекции в Ростовской области. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017; 16(6):37–40. DOI: 10.31631/2073-3046-2017-16-6-37-40.Kovalev E.V., Karpushchenko G.V., Schwager M.M., Polonsky A.V., Sidelnikov V.V., Goncharov A.Yu., Polovinka N.V. Features of distribution of tularemia infection in the Rostov Region. Epidemiologiya i Vaktsinoproflaktika. [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2017; 16(6):37–40. DOI: 10.31631/2073-3046-2017-16-6-37-40.Родионова И.В. Дифференциация географических рас Francisella tularensis на основании активности цитруллинуреидазы. Лабораторное дело. 1970; 1:42–3.Rodionova I.V. Differentiation of the geographical races of Francisella tularensis based on the activity of citrulline ureidase. Laboratornoe delo [Laboratory Practice]. 1970; 1: 42–3.Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Фосфатазная активность у представителей рода Francisella. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998; 1:10–3.Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V. The phosphatase activity in representatives of the genus Francisella. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii. [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1998; 1:10–3.Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Особенности формирования устойчивости Francisella tularensis subsp. mediasiatica к ß-лактамным антибиотикам. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 1:3–8.Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V. Features of resistance formation to β-lactam antibiotics in Francisella tularensis subsp. mediasiatica. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii. [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2014; 1:3–8.Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. СПб.; 2010. 48 с.Directive of the European Parliament and of the Council of the European Union on the protection of animals used for scientifc purposes 2010/63 / EU. St. Petersburg; 2010.48 p.Vogler A.J., Birdsell D., Wagner D.M., Keim P. An optimized, multiplexed multi‐locus variable‐number tandem repeat analysis system for genotyping Francisella tularensis. Lett. Appl. Microbiol. 2009; 48(1):140–4. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2008.02484.x.Vogler A.J., Birdsell D., Wagner D.M., Keim P. An optimized, multiplexed multi‐locus variable‐number tandem repeat analysis system for genotyping Francisella tularensis. Lett. Appl. Microbiol. 2009; 48(1):140–4. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2008.02484.x.Grissa I., Bouchon P., Pourcel C., Vergnaud G. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing. Biochimie. 2008; 90(4):660–8. DOI: 10.1016/j.biochi. 2007.07.014.Grissa I., Bouchon P., Pourcel C., Vergnaud G. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing. Biochimie. 2008; 90(4):660–8. DOI: 10.1016/j.biochi.2007.07.014.Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28:2731–9. DOI: 10.1093/molbev/msr121.Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28:2731–9. DOI: 10.1093/molbev/msr121.Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д., Титова С.В. Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae – разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016; 21(3):146–52. DOI: 10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152.Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Vodop’yanov S.O., Mishankin B.N., Oleynikov I.P., Kruglikov V.D., Titova S.V. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae – development of the algorithm for data analysis of whole genome sequencing. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2016; 21(3):146–52. DOI: 10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152.Транквилевский Д.В., Царенко В.А., Жуков В.И. Современное состояние эпизоотологического мониторинга за природными очагами инфекций в Российской Федерации. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2016; 2:19–24.Trankvilevsky D.V., Tsarenko V.A., Zhukov V.I. The current state of epizootic monitoring of natural foci of infections in the Russian Federation. Meditsinskaya Parazitologiya I Parazitarnye Bolezni. [Medical Parasitology and Parasitic Diseases]. 2016; 2: 19-24.Павлович Н.В., Цимбалистова М.В., Аронова Н.В., Горбатов А.А. Способ оценки вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holarctica. Патент РФ № 2018118456, опубл. 25.07.2019. Бюл. № 21.Pavlovich N.V., Tsimbalistova M.V., Aronova N.V., Gorbatov A.A. Method for in vitro virulence assessment of tularemia microbe strains of subspecies Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holarctica. RF patent No. 2018118456, publ. 07/25/2019. Bul. No. 21.Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., Аронова Н.В., Чайка И.А., Чайка С.О., Водопьянов А.С. Масс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микроба. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 4:92–6. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-4-92-96.Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V., Aronova N.V., Chaika I.A., Chaika S.O., Vodop’yanov A.S. Mass spectrometric analysis of natural and antigen-modifed strains of tularemia agent. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 4:92–6. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-4-92-96.Gyuranecz M., Birdsell D.N., Splettstoesser W., Seibold E., Beckstrom-Sternberg S.M., Makrai L., Fodor L., Fabbi M., Vicari N., Johansson A., Busch J.D., Vogler A.J., Keim P., Wagner D.M. Phylogeography of Francisella tularensis subsp. holarctica, Europe. Emerg. Infect. Dis. 2012; 18(2):290–3. DOI: 10.3201/eid1802.111305.Gyuranecz M., Birdsell D.N., Splettstoesser W., Seibold E., Beckstrom-Sternberg S.M., Makrai L., Fodor L., Fabbi M., Vicari N., Johansson A., Busch J.D., Vogler A.J., Keim P., Wagner D.M. Phylogeography of Francisella tularensis subsp. holarctica, Europe. Emerg. Infect. Dis. 2012; 18(2):290–3. DOI: 10.3201/eid1802.111305.Sissonen S., Rossow H., Karlsson E., Hemmilä H., Henttonen H., Isomursu M., Kinnunen P.M., Pelkola K., Pelkonen S., Tarkka E., Myrtennäs K., Nikkari S., Forsman M. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica in Finland, 1993–2011. Infect. Dis. (Lond). 2015; 47:701–6. DOI: 10.3109/23744235.2015.1049657.Sissonen S., Rossow H., Karlsson E., Hemmilä H., Henttonen H., Isomursu M., Kinnunen P.M., Pelkola K., Pelkonen S., Tarkka E., Myrtennäs K., Nikkari S., Forsman M. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica in Finland, 1993–2011. Infect. Dis. (Lond). 2015; 47:701–6. DOI: 10.3109/23744235.2015.1049657.Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Byström M., Fox J., Chu M.C., Forsman M., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186:5808–18. DOI: 10.1128/JB.186.17.5808-5818.2004.Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Byström M., Fox J., Chu M.C., Forsman M., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186:5808–18. DOI: 10.1128/JB.186.17.5808-5818.2004.Schulze C., Heuner K., Myrtennäs K., Karlsson E., Jacob D., Kutzer P., Große K., Forsman M., Grunow R. High and novel genetic diversity of Francisella tularensis in Germany and indication of environmental persistence. Epidemiol. Infect. 2016; 144(14):3025–36. DOI: 10.1017/S0950268816001175.Schulze C., Heuner K., Myrtennäs K., Karlsson E., Jacob D., Kutzer P., Große K., Forsman M., Grunow R. High and novel genetic diversity of Francisella tularensis in Germany and indication of environmental persistence. Epidemiol. Infect. 2016; 144(14):3025–36. DOI: 10.1017/S0950268816001175.ГнусареваО.А.,КотеневЕ.С., Волынкина А.С.,Чишенюк Т.И., Кулиниченко А.Н. Молекулярно-эпидемиологический анализ вспышки туляремии в Ставропольском крае в 2017 г. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2018; 7(3):57–61. DOI: 10.24411/2305-3496-2018-13008.Gnusareva O.A., Kotenev E.S., Volynkina A.S., Chishenyuk T.I., Kulichenko A.N. Molecular-epidemiological analysis of the tularemia outbreak in the Stavropol Territory in 2017. Infektsionnye Bolezni: Novosti, Mneniya, Obuchenie. [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2018; 7(3):57–61. DOI: 10.24411/2305-3496-2018-13008.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.