microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-4-90-95microbe-1596Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESКонструирование набора реагентов «ГенПест-подвид/алтай-РГФ»Construction of the Reagent Panel “GenPest-subspecies/Altai-RGF”https://orcid.org/0000-0002-4115-9486НикифоровК. А.NikiforovK. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2438-8364КуклеваЛ. М.KuklevaL. M.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruСитмбетовД. А.SitmbetovD. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0954-5683ОсинаН. А.OsinaN. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5403-989XЕрошенкоГ. А.EroshenkoG. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3788-3452КутыревВ. В.KutyrevV. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation202126012022049095Copyright © Никифоров К.А., Куклева Л.М., Ситмбетов Д.А., Осина Н.А., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., 20222022Никифоров К.А., Куклева Л.М., Ситмбетов Д.А., Осина Н.А., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В.Nikiforov K.A., Kukleva L.M., Sitmbetov D.A., Osina N.A., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1596

Цель – разработка набора реагентов, позволяющего проводить детекцию ДНК возбудителя чумы в пробах клинического и биологического материала, объектов окружающей среды с одновременным определением его принадлежности к основному и неосновным подвидам, дифференциацией отдельно алтайского биовара центральноазиатского подвида. Материалы и методы. На специфические генетические маркеры подобраны комплекты праймеров с помощью программы VectorNTI 10, определены оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции для приборов типа RotorGene. Для оценки специфичности и чувствительности разработанного набора реагентов использовано 44 штамма микроорганизмов, из которых 19 Yersinia pestis и 25 штаммов гетерологичных микроорганизмов. Диагностическая чувствительность «ГенПест-подвид/алтай-РГ Ф» – не менее 98,6 % при доверительной вероятности 91 %. Диагностическая специфичность «ГенПест-подвид/алтай-РГ Ф» – не менее 99 % при доверительной вероятности 91 %. Результаты и обсуждение. Разработано медицинское изделие «Набор реагентов для выявления и дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов (отдельно алтайского биовара центральноазиатского подвида) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ГенПест-подвид/алтай-РГ Ф)». Набор реагентов прошел государственную регистрацию в установленном порядке. Применение разработанного набора реагентов является актуальным для Горно-Алтайского высокогорного очага чумы РФ и сопредельной части Монголии.

The aim of the study was to develop a test system that allows for detecting plague pathogen DNA in clinical and biological samples, environmental objects with the simultaneous determination of its appurtenance to the main and non-main subspecies, differentiation of the altai biovar central asiatica subspecies separately. Materials and methods. Primer sets for specific genetic markers have been selected using the VectorNTI 10 software, optimal conditions for PCR were determined for RotorGene devices. To assess the specificity and sensitivity of the developed set of reagents, 44 strains of microorganisms were used, of which 19 were Yersinia pestis strains and 25 strains of heterologous microorganisms. The diagnostic sensitivity of “GenPest-subspecies/Altai-RGF” is 98.6 % with a confidence level of probability of 91 %. The diagnostic specificity of “GenPest-subspecies/Altai-RGF” is ≥ 99 % with a confidence level of 91 %. Results and discussion. A medical product “A set of reagents for the detection and differentiation of plague pathogen strains of the main and non-main subspecies (altai biovar, subspecies central asiatica exclusively) by the polymerase chain reaction with hybridization-fluorescent registration of results in real-time mode (GenPest-subspecies/Altai-RGF)” has been developed. The set of reagents passed the state registration in accordance with the established procedure. The use of the developed set of reagents is relevant for the Gorno-Altai high-mountain plague focus of the Russian Federation and the adjacent part of Mongolia.

чумавозбудитель чумыподвидовая дифференциацияалтайский биоварцентральноазиатский подвидПЦР -тест-системаplagueplague agentsubspecies differentiationaltai biovarsubspecies central asiaticaPCR test systemReferencesОнищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 191 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Natural Plague Foci in the Territory of Caucasus, Caspian Sea Region, Central Asia and Siberia]. Moscow: “Medicine”; 2004. 191 p.Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov Y.M., Kukleva L.M., Nikiforov K.A., Al’khova Z.V., Oglodin E.G., Guseva N.P. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9:1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov Y.M., Kukleva L.M., Nikiforov K.A., Al’khova Z.V., Oglodin E.G., Guseva N.P. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9:1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.Попов Н.В., Ерошенко Г.А., Карнаухов И.Г., Кузнецов А.А., Матросов А.Н., Иванова А.В., Поршаков А.М., Ляпин М.Н., Корзун В.М., Вержуцкий Д.Б., Аязбаев Т.З., Лопатин А.А., Ашибоков У.М., Балахонов С.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Эпидемиологическая и эпизоотическая обстановка по чуме в Российской Федерации и прогноз ее развития на 2020–2025 гг. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 1:43–50. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-1-43-50.Popov N.V., Eroshenko G.A., Karnaukhov I.G., Kuznetsov A.A., Matrosov A.N., Ivanova A.V., Porshakov A.M., Lyapin M.N., Korzun V.M., Verzhutsky D.B., Ayazbaev T.Z., Lopatin A.A., Ashibokov U.M., Balakhonov S.V., Kulichenko A.N., Kutyrev V.V. [Epidemiological and epizootic situation on plague in the Russian Federation and forecast for its development for 2020–2025]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (1):43–50. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-1-43-50.Кутырев В.В., Попова А.Ю., Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Шарова И.Н., Мищенко А.И., Рождественский Е.Н., Базарова Г.Х., Михайлов Е.П., Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Куклева Л.М., Черкасов А.В., Оглодин Е.Г., Куклев В.Е., Одиноков Г.Н., Щербакова С.А., Балахонов С.В., Афанасьев М.В., Витязева С.А., Шестопалов М.Ю., Климов В.Т. Заболевание человека чумой в Горно-Алтайском высокогорном природном очаге в 2014 г. Сообщение 2. Особенности лабораторной диагностики и молекулярно-генетическая характеристика выделенных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2014; 4:43–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-4-43-51.Kutyrev V.V., Popova A.Yu., Ezhlova E.B., Demina Yu.V., Pakskina N.D., Sharova I.N., Mishchenko A.I., Rozhdestvensky E.N., Bazarova G.K., Mikhailov E.P., Eroshenko G.A., Krasnov Y.M., Kukleva L.M., Cherkasov A.V., Oglodin E.G., Kuklev V.E., Odinokov G.N., Shcherbakova S.A., Balakhonov S.V., Afanas’ev M.V., Vityazeva S.A., Shestopalov M.Yu., Klimov V.T. [Infection of an individual with plague in the Gorno-Altaisk High-Mountain Natural Focus in 2014. Communication 2. Peculiarities of laboratory diagnostics and molecular-genetic characterization of the isolated strains]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2014; (4):43–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-4-43-51.Балахонов С.В., Ярыгина М.Б., Рождественский Е.Н., Базарова Г.Х., Витязева С.А., Остяк А.С., Михайлов Е.П., Мищенко А.И., Денисов А.В., Косилко С.А., Корзун В.М. Случай заболевания человека чумой в Кош-Агачском районе Республики Алтай в 2015 г. Сообщение 2. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика изолированных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 4:51–5. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-51-55.Balakhonov S.V., Yarygina M.B., Rozhdestvensky E.N., Bazarova G.K., Vityazeva S.A., Ostyak A.S., Mikhailov E.P., Mishchenko A.I., Denisov A.V., Kosilko S.A., Korzun V.M. [A case of human plague in Kosh-Agach Region of the Republic of Altai in 2015. Communication 2. Microbiological and molecular-genetic characteristics of the isolated strains]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (4):51–5. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-51-55.Rahalison L., Vololonirina E., Ratsitorahina M., Chanteau S. Diagnosis of bubonic plague by PCR in Madagascar under field conditions. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(1):260–3. DOI: 10.1128/JCM.38.1.260-263.2000.Rahalison L., Vololonirina E., Ratsitorahina M., Chanteau S. Diagnosis of bubonic plague by PCR in Madagascar under field conditions. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(1):260–3. DOI: 10.1128/JCM.38.1.260-263.2000.Bai Y., Motin V., Enscore R.E., Osikowicz L., Rosales Rizzo M., Hojgaard A., Kosoy M., Eisen R.J. Pentaplex real-time PCR for differential detection of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis and application for testing fleas collected during plague epizootics. MicrobiologyOpen. 2020; 9(10):e1105. DOI: 10.1002/mbo3.1105.Bai Y., Motin V., Enscore R.E., Osikowicz L., Rosales Rizzo M., Hojgaard A., Kosoy M., Eisen R.J. Pentaplex real-time PCR for differential detection of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis and application for testing fleas collected during plague epizootics. MicrobiologyOpen. 2020; 9(10):e1105. DOI: 10.1002/mbo3.1105.Kane S.R., Shah S.R., Alfaro T.M. Development of a rapid viability polymerase chain reaction method for detection of Yersinia pestis. J. Microbiol. Methods. 2019; 162:21–7. DOI: 10.1016/j.mimet.2019.05.005.Kane S.R., Shah S.R., Alfaro T.M. Development of a rapid viability polymerase chain reaction method for detection of Yersinia pestis. J. Microbiol. Methods. 2019; 162:21–7. DOI: 10.1016/j.mimet.2019.05.005.Raktoe R.S., Rietveld M.H., Out-Luiting J.J., Kruithofde Julio M., van Zuijlen P.P., van Doorn R., Ghalbzouri A.E. Exon skipping of TGFβRI affects signalling and ECM expression in hypertrophic scar-derived fibroblasts. Scars Burn. Heal. 2020; 6:2059513120908857. DOI: 10.1177/2059513120908857.Raktoe R.S., Rietveld M.H., Out-Luiting J.J., Kruithofde Julio M., van Zuijlen P.P., van Doorn R., Ghalbzouri A.E. Exon skipping of TGFβRI affects signalling and ECM expression in hypertrophic scar-derived fibroblasts. Scars Burn. Heal. 2020; 6:2059513120908857. DOI: 10.1177/2059513120908857.Mölsä M., Hemmilä H., Katz A., Niemimaa J., Forbes K.M., Huitu O., Stuart P., Henttonen H., Nikkari S. Monitoring biothreat agents (Francisella tularensis, Bacillus anthracis and Yersinia pestis) with a portable real-time PCR instrument. J. Microbiol. Methods. 2015; 115:89–93. DOI: 10.1016/j.mimet.2015.05.026.Mölsä M., Hemmilä H., Katz A., Niemimaa J., Forbes K.M., Huitu O., Stuart P., Henttonen H., Nikkari S. Monitoring biothreat agents (Francisella tularensis, Bacillus anthracis and Yersinia pestis) with a portable real-time PCR instrument. J. Microbiol. Methods. 2015; 115:89–93. DOI: 10.1016/j.mimet.2015.05.026.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases. Practice Guidelines]. Moscow: JSC “Shiko”; 2013. 560 p.Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Германчук В.Г., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Подвидовая дифференциация штаммов Yersinia pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 2:22–7.Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Germanchuk V.G., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. [Subspecific differentiation of Yersinia pestis strains by PCR with hybridization-fluorescent registration of results]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2017; 2:22–7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.