microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2021-4-120-127microbe-1600Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESТест-система для идентификации типичных и генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор методом ПЦР в режиме реального времениTest-System for Identification of Typical and Genetically Altered Variants of Cholera Vibrios, Biovar El Tor, Using Real-Time PCRhttps://orcid.org/0000-0001-6458-3725СавельевВ. Н.Savel’evV. N.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

stavnipchi@mail.ruКуличенкоА. Н.KulichenkoA. N.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-1254-2259СавельеваИ. В.Savel’evaI. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-9366-5647КовалевД. А.KovalevD. A.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-8070-0706ТаранТ. В.TaranT. V.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-4549-9701ПодопригораЕ. И.PodoprigoraE. I.

Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation

СосуновВ. В.SosunovV. V.

Российская Федерация, 127238, Москва, Локомотивный пр., 9

9, Lokomotivny Avenue, Moscow, 127238, Russian Federation

info@oligos.ruРадаеваТ. В.RadaevaT. V.

Российская Федерация, 127238, Москва, Локомотивный пр., 9

9, Lokomotivny Avenue, Moscow, 127238, Russian Federation

ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»РоссияStavropol Research Anti-Plague InstituteRussian FederationООО «ДНК-СИНТЕЗ»Россия“DNK-SINTEZ” LLCRussian Federation20212601202204120127Copyright © Савельев В.Н., Куличенко А.Н., Савельева И.В., Ковалев Д.А., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Сосунов В.В., Радаева Т.В., 20222022Савельев В.Н., Куличенко А.Н., Савельева И.В., Ковалев Д.А., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Сосунов В.В., Радаева Т.В.Savel’ev V.N., Kulichenko A.N., Savel’eva I.V., Kovalev D.A., Taran T.V., Podoprigora E.I., Sosunov V.V., Radaeva T.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1600

Цель работы – анализ и оценка результатов ПЦР -тест-системы «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» для идентификации Vibrio cholerae O1 с дифференциацией на типичные токсигенные и генетически измененные варианты в мультиплексном формате с гибридизационно-флуоресцентным методом учета результатов в режиме реального времени. Материалы и методы. Для достижения указанной цели в работе представлен набор реагентов ПЦР -тест-системы «Гены V. cholerae О1 вариант ctxB-rtxC, FL», а также способ осуществления идентификации V. cholerae O1 с дифференциацией на типичные токсигенные и генетически измененные варианты. Изучены специфичность, специфическая активность и чувствительность разработанной тест-системы на 35 штаммах V. cholerae O1, 6 штаммах V. cholerae non O1, 5 гетерологичных штаммах (Shigella zonnei – 2 штамма, по одному штамму Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Escherichia coli). Результаты и обсуждение. Набор реагентов ПЦР -тест-системы «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» выявляет в геноме токсигенных V. cholerae О1 фрагменты ДНК генов ctxBСl, ctxBEl, rtxC (обладает специфической активностью, аналитическая чувствительность 1∙103 ГЭ /мл) и не обнаруживает данные гены у нетоксигенных V. cholerae О1 и non O1, а также у гетерологичных штаммов микроорганизмов (показана специфичность 100 %). На ПЦР -тест-систему «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» получен патент РФ № 2732448, опубл. 24.08.2020, бюл. № 24. ПЦР -тест-система «Гены Vibrio cholerae О1 вариант ctxB-rtxC, FL» может быть использована для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за холерой и проведения обоснованного объема противоэпидемических мероприятий в случае ее завоза на территорию Российской Федерации.

The aim of the work was to analyze and assess the results of using PCR test-system “V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes” for identification of Vibrio cholerae O1 with differentiation between typical toxigenic and genetically modified variants in a multiplex format with a real-time hybridization-fluorescent recording of results. Materials and methods. To achieve this goal, a set of reagents for the PCR test-system “V. cholerae O1 variant ctxB-rtxC FL genes”, as well as a method for identifying V. cholerae O1 with differentiation between typical toxigenic and genetically altered variants were utilized. The specificity, specific activity and sensitivity of the developed test-system by the example of 35 V. cholerae O1 strains, 6 V. cholerae non-O1 strains, 5 heterologous strains (Shigella zonnei – 2 strains, one Salmonella typhimurium strain, S. enteritidis, Escherichia coli) were investigated. Results and discussion. The panel of reagents for the PCR test system “V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes” detects DNA fragments of the ctxBCl, ctxBEl, rtxC genes in the genome of toxigenic V. cholerae О1 (has specific activity, analytical sensitivity 1·103 GE/ml) and does not detect these genes in non-toxigenic V. cholerae O1 and non-O1, as well as in heterologous strains of microorganisms (100 % specificity). RF Patent No. 2732448 was granted for the PCR test-system “V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes”. It can be used to increase the efficiency of the epidemiological surveillance system and to carry out a justified scope of anti-epidemic measures in the event of cholera importation into the territory of the Russian Federation.

типичные токсигенные и генетически измененные варианты холерного вибриона биовара Эль ТорПЦР -тест-система для идентификации возбудителя холерыtypical toxigenic and genetically modified variants of Vibrio cholerae biovar El TorPCR test-system for identification of the causative agent of choleraReferencesDe Haan L., Hirst T.R. Cholera toxin: a paradigm for multifunctional engagement of cellular mechanisms. Mol. Membr. Biol. 2004; 21(2):77–92. DOI: 10.1080/09687680410001663267.De Haan L., Hirst T.R. Cholera toxin: a paradigm for multifunctional engagement of cellular mechanisms. Mol. Membr. Biol. 2004; 21(2):77–92. DOI: 10.1080/09687680410001663267.Dziejman M.E., Balon D., Boyd C.M., Fraser J.F., Heidelberg J.J., Mekalanos J.J. Comparative genomicanalysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(3):1556–61. DOI: 0.1073/pnas.042667999.Dziejman M.E., Balon D., Boyd C.M., Fraser J.F., Heidelberg J.J., Mekalanos J.J. Comparative genomicanalysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(3):1556–61. DOI: 0.1073/pnas.042667999.Pradhan S., Baidya A.K., Ghosh A., Paul K., Chowdhury R. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. J. Bacteriol. 2010; 192(4):955–63. DOI: 10.1128/JB.01180-09.Pradhan S., Baidya A.K., Ghosh A., Paul K., Chowdhury R. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. J. Bacteriol. 2010; 192(4):955–63. DOI: 10.1128/JB.01180-09.Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.П., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio choleraе биовара Эль Тор, изолированных на территории России в современный период. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 3:11–7.Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.P., Kutyrev V.V. [Genome variability of altered variants of Vibrio choleraе biovar El Tor isolated on the territory of Russia in the modern period]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2011; 3:11–7.Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 eltor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 15(6):987–8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 eltor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 15(6):987–8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T., Choi S.Y., Hien N.T., Anh D.D., Lee H.R., Ansaruzzaman M., Endtz H.P., Chun J., Lopez A.L., Czerkinsky C., Clemens J.D., Kim D.W. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain produsing classical toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(5):1568–71. DOI: 10.1128/JCM.02040-08.Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T., Choi S.Y., Hien N.T., Anh D.D., Lee H.R., Ansaruzzaman M., Endtz H.P., Chun J., Lopez A.L., Czerkinsky C., Clemens J.D., Kim D.W. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain produsing classical toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(5):1568–71. DOI: 10.1128/JCM.02040-08.Raychoudhuri A., Patra T., Ghosh K., Ramamurthy T., Nandy R.K., Takeda Y., Balakrish-Nair G., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1):131–2. DOI: 10.3201/eid1501.080543.Raychoudhuri A., Patra T., Ghosh K., Ramamurthy T., Nandy R.K., Takeda Y., Balakrish-Nair G., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1):131–2. DOI: 10.3201/eid1501.080543.Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46–54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46–54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor end classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor end classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E., Haley B., Chun J., Brettin T.S., Bruce D.C., Detter J.C., Han C.S., Chertkov O., Challacombe J., Huq A., Nair G.B., Colwell R.R. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae O1 MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol. 2010; 192(13):3524–33. DOI: 10.1128/JB.00040-10.Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E., Haley B., Chun J., Brettin T.S., Bruce D.C., Detter J.C., Han C.S., Chertkov O., Challacombe J., Huq A., Nair G.B., Colwell R.R. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae O1 MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol. 2010; 192(13):3524–33. DOI: 10.1128/JB.00040-10.Siddique A.K., Nair G.B., Alam M., Sack D.A., Huq A., Nizam A., Longini I.M. Jr., Qadri F., Faruque S.M., Colwell R.R., Ahmed S., Iqbal A., Bhuiyan N.A., Sack R.B. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and beyond. Epidemiol. Infect. 2010; 138(3):347–52. DOI: 10.1017/S0950268809990550.Siddique A.K., Nair G.B., Alam M., Sack D.A., Huq A., Nizam A., Longini I.M. Jr., Qadri F., Faruque S.M., Colwell R.R., Ahmed S., Iqbal A., Bhuiyan N.A., Sack R.B. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and beyond. Epidemiol. Infect. 2010; 138(3):347–52. DOI: 10.1017/S0950268809990550.Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M., Siddique A.K., Qadri F., Izumiya H., Nair G.B., Watanabe H. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholеrae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52(6):314–7. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2008.00041.x.Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M., Siddique A.K., Qadri F., Izumiya H., Nair G.B., Watanabe H. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholеrae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52(6):314–7. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2008.00041.x.Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211–3. DOI: 10.1128/JCM.01304-06.Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211–3. DOI: 10.1128/JCM.01304-06.Савельева И.В., Куличенко А.Н., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Савельев В.Н. Эволюция генома холерного вибриона биовара Эль Тор и разработка ПЦР -тест-системы для идентификации штаммов возбудителя холеры. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы Проблемной комиссии. Ростов н/Д; 2017. Вып. 30. С. 172–7.Savel’eva I.V., Kulichenko A.N., Kovalev D.A., Zhirov A.M., Savel’ev V.N. [Evolution of the genome of Vibrio cholerae biovar El Tor and the development of a PCR test-system for the identification of cholera pathogen strains]. In: [Cholera and Vibrios Pathogenic for Humans: Proceedings of the Problem Commission]. Rostov-on-Don; 2017. Vol. 30. P. 172–7.Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В., Заднова С.П., Кутырев В.В. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ № 2458141, опубл. 10.08.2012. Бюл. № 22.Smirnova N.I., Goryaev A.A., Shubina A.V., Zadnova S.P., Kutyrev V.V. Method for identification of toxigenic V. cholerae O1 strains, determination of their biovar and differentiation of El Tor biovar strains into typical and modified by multiplex polymerase chain reaction and a test system for its implementation. RF patent No. 2458141, publ. 10.08.2012. Bul. No. 22.Шашкова А.В., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Конструирование ПЦР -тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов Эль Тор вибрионов на типичные и измененные. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 4(110):49–52. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-49-52.Shashkova A.V., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I., Kutyrev V.V. Construction of the PCR testsystem for the detection of Vibrio cholerae O1 toxigenic strains, for indication of their biovar and for differentiation between typical and altered El Tor-vibrio strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2011; (4(110)):49–52. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-49-52.Савельев В.Н., Савельева И.В., Сосунов В.В, Ковалев Д.А., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Гусева Л.В. Способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме «реального времени». Патент РФ № 2732448, опубл. 16.09.2020. Бюл. № 26.Savel’ev V.N., Savel’eva I.V., Sosunov V.V., Kovalev D.A., Podoprigora E.I., Vasil’eva O.V., Guseva L.V. Method for identification of Vibrio cholerae O1 strains, determination of their toxigenicity and biovar with differentiation of El Tor biovar into typical and genetically modified variants by multiplex polymerase chain reaction, and a test system for its implementation with registration of results in real-time mode. RF patent No. 2732448, publ. 16.09.2020. Bul. No. 26.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.