microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-1-86-93microbe-1661Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВыделение гликопротеина вируса бешенства методом трехфазной экстракции и характеристика его антигенных свойствIsolation of Rabies Virus Glycoprotein Using Three-Phase Extraction and Characteristics of its Antigenic Propertieshttps://orcid.org/0000-0001-8786-1310ЕфимоваМ. А.EfimovaM. A.

420075, Казань, Научный городок-2; 420029, Казань, ул. Сибирский Тракт, 35

Nauchny Gorodok-2, Kazan, 420075; 35, Siberian Tract St., Kazan, 420029

АхмадеевР. М.AkhmadeevR. M.

420075, Республика Татарстан, Казань, Научный городок-2

Nauchny Gorodok-2, Kazan, 420075

vnivi@vnivi.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2650-6459ГалееваА. Г.GaleevaA. G.

420075, Республика Татарстан, Казань, Научный городок-2

Nauchny Gorodok-2, Kazan, 420075

https://orcid.org/0000-0001-5218-9341ВалееваА. Р.ValeevaA. R.

420012, Казань, ул. Муштари, 11

11, Mushtari St., Kazan, 420012

МифтаховН. Р.MiftakhovN. R.

420075, Республика Татарстан, Казань, Научный городок-2

Nauchny Gorodok-2, Kazan, 420075

https://orcid.org/0000-0002-5996-0271МукминовМ. Н.MukminovM. N.

420012, Казань, ул. Муштари, 11; 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18

11, Mushtari St., Kazan, 420012; 18, Kremlin St., Kazan, 420008

https://orcid.org/0000-0003-4764-560XХаертыновК. С.KhaertynovK. S.

420075, Казань, Научный городок-2; 420012, Казань, ул. Муштари, 11

Nauchny Gorodok-2, Kazan, 420075; 11, Mushtari St., Kazan, 420012

https://orcid.org/0000-0003-0650-3090ШуралевЭ. А.ShuralevЕ. A.

420029, Казань, ул. Сибирский Тракт, 35; 420012, Казань, ул. Муштари, 11; 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18

35, Siberian Tract St. , Kazan, 420029; 11, Mushtari St., Kazan, 420012; 18, Kremlin St., Kazan, 420008

ФГБНУ Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности; ФГБОУ ВО Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. БауманаРоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety; Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. BaumanRussian FederationФГБНУ Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасностиРоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological SafetyRussian FederationКазанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияKazan State Medical Academy – affiliated branch of the Russian Medical Academy of Continuing Professional Education of the Ministry of Health of RussiaRussian FederationКазанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университетРоссияKazan State Medical Academy – affiliated branch of the Russian Medical Academy of Continuing Professional Education of the Ministry of Health of Russia; Kazan (Volga Region) Federal UniversityRussian FederationФГБНУ Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности; Казанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety; Kazan State Medical Academy – affiliated branch of the Russian Medical Academy of Continuing Professional Education of the Ministry of Health of RussiaRussian FederationФГБОУ ВО Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана; Казанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университетРоссияKazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman; Kazan State Medical Academy – affiliated branch of the Russian Medical Academy of Continuing Professional Education of the Ministry of Health of Russia; Kazan (Volga Region) Federal UniversityRussian Federation202219042022018693Copyright © Ефимова М.А., Ахмадеев Р.М., Галеева А.Г., Валеева А.Р., Мифтахов Н.Р., Мукминов М.Н., Хаертынов К.С., Шуралев Э.А., 20222022Ефимова М.А., Ахмадеев Р.М., Галеева А.Г., Валеева А.Р., Мифтахов Н.Р., Мукминов М.Н., Хаертынов К.С., Шуралев Э.А.Efimova M.A., Akhmadeev R.M., Galeeva A.G., Valeeva A.R., Miftakhov N.R., Mukminov M.N., Khaertynov K.S., Shuralev Е.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1661

Цель работы – разработка методического подхода к выделению гликопротеина вируса бешенства с использованием трехфазной экстракции и характеристика его антигенных свойств.

Материалы и методы

Материалы и методы. Инфекционную активность вируса бешенства (производственный штамм «Овечий» ГНКИ) после длительного хранения восстанавливали на белых мышах линии BALB/c. Штамм использовали для культивирования на клетках линии ВНК-21; культуральную жидкость концентрировали методом ультрацентрифугирования с последующим разделением ее по плавучей плотности в градиенте сахарозы, отбором визуально опалесцирующих зон, фазовым концентрированием, хроматографическим разделением на колонке ENrich™ SEC650 (Bio-Rad, США) и отбором мономерных фракций с высокой серологической активностью по результатам вестерн-блоттинга.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Показано, что предварительное механическое разрушение суспензии головного мозга, извлечение вируссодержащего материала из клеточной суспензии путем последовательных этапов центрифугирования, разделение осадка, полученного в градиенте сахарозы, c дальнейшей очисткой фазовым концентрированием и хроматографическим разделением преципитата позволяет получать мономерный препарат с высокой серологической активностью. Данный подход позволил получить антиген, представляющий собой гликопротеин вируса бешенства с молекулярной массой 67 кДа и две его изоформы с молекулярной массой 60 и 54 кДа. Описанный подход можно рассматривать в качестве варианта выделения специфического антигена вируса бешенства при проведении работ по совершенствованию методов лабораторной диагностики. Полученный антиген является мономерным дискретом и содержит одну фракцию молекулярной массой 67 кДа. Результаты исследований подтверждают высокую специфичность антигена и его пригодность для конструирования иммуноферментных и иммунохроматографических тестов, получения специфических иммуноглобулинов, рецепторного изучения взаимодействия антиген/антитело, а также для оценки напряженности протективного иммунитета после вакцинации.

The aim of the work was to develop an approach to isolation of rabies virus glycoprotein applying threephase extraction and to characterize its antigenic properties.

Materials and methods

Materials and methods. Infectious activity of the rabies virus (production strain, “Ovine” GNKI) after long-term storage was restored on white BALB/c mice. The strain was used for cultivation on BHK-21 cells; the culture liquid was concentrated applying ultracentrifugation followed by separation by buoyant density in a sucrose gradient, selection of visually opalescent zones, phase concentration, chromatographic separation on an ENrich™ SEC650 column (Bio-Rad, USA) and selection of monomeric fractions with high serological activity according to the results of Western blotting.

Results and discussion

Results and discussion. We have demonstrated that preliminary mechanical destruction of brain suspension, extraction of the virus-containing material from the cell suspension through successive low-speed and high-speed centrifugation, separation of the sediment produced in sucrose gradient with further phase concentration and chromatographic separation of the precipitate allows to obtain monomeric antigenic preparations with high serological activity. This methodology has made it possible to obtain an antigen, which is rabies virus glycoprotein with a molecular weight of 67 kDa, and two of its isoforms, having molecular weights of 60 and 54 kDa. The described approach can be viewed as an option for isolation of the rabies virus specific antigen when improving laboratory diagnostics techniques. The resulting antigen is a monomeric discrete containing one fraction with a molecu lar weight of 67 kDa. The data obtained corroborate the high specificity of the antigen and its suitability for the design of enzyme immunoassay and immunochromatographic tests, production of specific immunoglobulins, the study of the antigen/antibody interaction, as well as for the assessment of the protective immunity intensity after vaccination.

гликопротеин вируса бешенствафазовая экстракциявестерн-блоттинггель-фильтрационная хроматографияrabies virus glycoproteinphase extractionWestern blottinggel filtration chromatographyReferencesFooks A.R., Shipley R., Markotter W., Tordo N., Freuling C.M., Müller T., McElhinney L.M., Banyard A.C., Rupprecht C.E. Renewed public health threat from emerging lyssaviruses. Viruses. 2021; 13(9):1769. DOI: 10.3390/v13091769.Fooks A.R., Shipley R., Markotter W., Tordo N., Freuling C.M., Müller T., McElhinney L.M., Banyard A.C., Rupprecht C.E. Renewed public health threat from emerging lyssaviruses. Viruses. 2021; 13(9):1769. DOI: 10.3390/v13091769.Elmgren L.D., Nadin-Davis S.A., Muldoon F.T., Wandeler A.I. Diagnosis and analysis of a recent case of human rabies in Canada. Can. J. Infect. Dis. 2002; 13(2):129–33. DOI: 10.1155/2002/235073.Elmgren L.D., Nadin-Davis S.A., Muldoon F.T., Wandeler A.I. Diagnosis and analysis of a recent case of human rabies in Canada. Can. J. Infect. Dis. 2002; 13(2):129–33. DOI: 10.1155/2002/235073.Saengseesom W., Mitmoonpitak C., Kasempimolporn S., Sitprija V. Real-time PCR analysis of dog cerebrospinal fluid and saliva samples for ante-mortem diagnosis of rabies. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2007; 38(1):53–7.Saengseesom W., Mitmoonpitak C., Kasempimolporn S., Sitprija V. Real-time PCR analysis of dog cerebrospinal fluid and saliva samples for ante-mortem diagnosis of rabies. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2007; 38(1):53–7.Shulpin M.I., Nazarov N.A., Chupin S.A., Korennoy F.I., Metlin A.Ye., Mischenko A.V. Rabies surveillance in the Russian Federation. Rev. Sci. Tech. 2018; 37(2):483–95. DOI: 10.20506/rst.37.2.2817.Shulpin M.I., Nazarov N.A., Chupin S.A., Korennoy F.I., Metlin A.Ye., Mischenko A.V. Rabies surveillance in the Russian Federation. Rev. Sci. Tech. 2018; 37(2):483–95. DOI: 10.20506/rst.37.2.2817.Hicks D.J., Fooks A.R., Johnson N. Developments in rabies vaccines. Clin. Exp. Immunol. 2012; 169(3):199–204. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2012.04592.x.Hicks D.J., Fooks A.R., Johnson N. Developments in rabies vaccines. Clin. Exp. Immunol. 2012; 169(3):199–204. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2012.04592.x.Mani R.S., Madhusudana S.N. Laboratory diagnosis of hu- man rabies: recent advances. Sci. World J. 2013; 2013:569712. DOI: 10.1155/2013/569712.Mani R.S., Madhusudana S.N. Laboratory diagnosis of hu- man rabies: recent advances. Sci. World J. 2013; 2013:569712. DOI: 10.1155/2013/569712.Fontana D., Kratje R., Etcheverrigaray M., Prieto C. Rabies virus-like particles expressed in HEK293 cells. Vaccine. 2014; 32(24):2799–804. DOI: 10.1016/j.vaccine.2014.02.031.Fontana D., Kratje R., Etcheverrigaray M., Prieto C. Rabies virus-like particles expressed in HEK293 cells. Vaccine. 2014; 32(24):2799–804. DOI: 10.1016/j.vaccine.2014.02.031.Kang H., Qi Y., Wang H., Zheng X., Gao Y., Li N., Yang S., Xia X. Chimeric rabies virus-like particles containing membrane-an- chored GM-CSF enhances the immune response against rabies virus. Viruses. 2015; 7(3):1134–52. DOI: 10.3390/v7031134.Kang H., Qi Y., Wang H., Zheng X., Gao Y., Li N., Yang S., Xia X. Chimeric rabies virus-like particles containing membrane-an- chored GM-CSF enhances the immune response against rabies virus. Viruses. 2015; 7(3):1134–52. DOI: 10.3390/v7031134.Gaudin Y., Ruigrok R.W., Tuffereau C., Knossow M., Flamand A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 1992; 187(2):627–32. DOI: 10.1016/0042-6822(92)90465-2.Gaudin Y., Ruigrok R.W., Tuffereau C., Knossow M., Flamand A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 1992; 187(2):627–32. DOI: 10.1016/0042-6822(92)90465-2.Morimoto K., Foley H.D., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Reinvestigation of the role of the ra- bies virus glycoprotein in viral pathogenesis using a reverse genetics approach. J. Neurovirol. 2000; 6(5):373–81. DOI: 10.3109/13550280009018301.Morimoto K., Foley H.D., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Reinvestigation of the role of the ra- bies virus glycoprotein in viral pathogenesis using a reverse genetics approach. J. Neurovirol. 2000; 6(5):373–81. DOI: 10.3109/13550280009018301.Li C., Zhang H., Ji L., Wang X., Wen Y., Li G., Fu Zh.F., Yang Y. Deficient incorporation of rabies virus glycoprotein into viri- ons enhances virus-induced immune evasion and viral pathogenicity. Viruses. 2019; 11(3):218. DOI: 10.3390/v11030218.Li C., Zhang H., Ji L., Wang X., Wen Y., Li G., Fu Zh.F., Yang Y. Deficient incorporation of rabies virus glycoprotein into viri- ons enhances virus-induced immune evasion and viral pathogenicity. Viruses. 2019; 11(3):218. DOI: 10.3390/v11030218.Schnee M., Vogel A.B., Voss D., Petsch B., Baumhof P., Kramps T., Stitz L. An mRNA vaccine encoding rabies virus glyco- protein induces protection against lethal infection in mice and corre- lates of protection in adult and newborn pigs. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(6):e0004746. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004746.Schnee M., Vogel A.B., Voss D., Petsch B., Baumhof P., Kramps T., Stitz L. An mRNA vaccine encoding rabies virus glyco- protein induces protection against lethal infection in mice and corre- lates of protection in adult and newborn pigs. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(6):e0004746. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004746.Ramya R., Mohana Subramanian B., Sivakumar V., Senthilkumar R.L., Sambasiva Rao K.R.S., Srinivasan V.A. Expression and solubilization of insect cell-based rabies virus gly- coprotein and assessment of its immunogenicity and protective ef- ficacy in mice. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18(10):1673–9. DOI: 10.1128/CVI.05258-11.Ramya R., Mohana Subramanian B., Sivakumar V., Senthilkumar R.L., Sambasiva Rao K.R.S., Srinivasan V.A. Expression and solubilization of insect cell-based rabies virus gly- coprotein and assessment of its immunogenicity and protective ef- ficacy in mice. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18(10):1673–9. DOI: 10.1128/CVI.05258-11.Osakada F., Callaway E.M. Design and generation of re- combinant rabies virus vectors. Nat. Protoc. 2013; 8(8):1583–601. DOI: 10.1038/nprot.2013.094.Osakada F., Callaway E.M. Design and generation of re- combinant rabies virus vectors. Nat. Protoc. 2013; 8(8):1583–601. DOI: 10.1038/nprot.2013.094.Sokol F., Stancek D., Koprowski H. Structural proteins of rabies virus. J. Virol. 1971; 7(2):241–9. DOI: 10.1128/JVI.7.2.241-249.1971.Sokol F., Stancek D., Koprowski H. Structural proteins of rabies virus. J. Virol. 1971; 7(2):241–9. DOI: 10.1128/JVI.7.2.241-249.1971.Koser M.L., McGettigan J.P., Tan G.S., Smith M.E., Koprowski H., Dietzschold B., Schnell M.J. Rabies virus nucleo- protein as a carrier for foreign antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004; 101(25):9405–10. DOI: 10.1073/pnas.0403060101.Koser M.L., McGettigan J.P., Tan G.S., Smith M.E., Koprowski H., Dietzschold B., Schnell M.J. Rabies virus nucleo- protein as a carrier for foreign antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004; 101(25):9405–10. DOI: 10.1073/pnas.0403060101.Masatani T., Ito N., Ito Yu., Nakagawa K., Abe M., Yamaoka S., Okadera K., Sugiyama M. Importance of rabies virus nucleopro- tein in viral evasion of interferon response in the brain. Microbiol Immunol. 2013; 57(7):511–7. DOI: 10.1111/1348-0421.12058.Masatani T., Ito N., Ito Yu., Nakagawa K., Abe M., Yamaoka S., Okadera K., Sugiyama M. Importance of rabies vi- rus nucleoprotein in viral evasion of interferon response in the brain. Microbiol Immunol. 2013; 57(7):511–7. DOI: 10.1111/1348-0421.12058.Faber M., Pulmanausahakul R., Hodawadekar S.S., Spitsin S., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Overexpression of the Rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response. J. Virol. 2002; 76(7):3374–81. DOI: 10.1128/jvi.76.7.3374-3381.2002.Faber M., Pulmanausahakul R., Hodawadekar S.S., Spitsin S., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Overexpression of the Rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response. J. Virol. 2002; 76(7):3374–81. DOI: 10.1128/jvi.76.7.3374-3381.2002.Gupta P.K., Sharma S., Walunj S.S., Chaturvedi V.K., Raut A.A., Patial S., Rai A., Pandey K D., Saini M. Immunogenic and antigenic properties of recombinant soluble glycoprotein of rabies virus. Vet. Microbiol. 2005; 1:108(3-4):207–14. DOI: 10.1016/j.vetmic.2005.04.007.Gupta P.K., Sharma S., Walunj S.S., Chaturvedi V.K., Raut A.A., Patial S., Rai A., Pandey K D., Saini M. Immunogenic and antigenic properties of recombinant soluble glycoprotein of rabies virus. Vet. Microbiol. 2005; 1:108(3-4):207–14. DOI: 10.1016/j. vetmic.2005.04.007.Cox J.H., Dietzschold B., Schneider L.G. Rabies virus glycoprotein. II. Biological and serological characterization. Infect. Immun. 1977; 16(3):754–9. DOI: 10.1128/IAI.16.3.754-759.1977.Cox J.H., Dietzschold B., Schneider L.G. Rabies virus glycoprotein. II. Biological and serological characterization. Infect. Immun. 1977; 16(3):754–9. DOI: 10.1128/IAI.16.3.754-759.1977.Dastkhosh M., Rahimi P., Haghighat S., Biglari P., Howaizi N., Saghiri R., Roohandeh A. Cell culture extraction and purifica- tion of rabies virus nucleoprotein. Jundishapur J. Microbiol. 2014; 7(9):е11734. DOI: 10.5812/jjm.11734.Dastkhosh M., Rahimi P., Haghighat S., Biglari P., Howaizi N., Saghiri R., Roohandeh A. Cell culture extraction and purifica- tion of rabies virus nucleoprotein. Jundishapur J. Microbiol. 2014; 7(9):е11734. DOI: 10.5812/jjm.11734.Smith G., Liu Y. Rabies glycoprotein virus-like particles (VLPs). 2012; WO/2012/061815.Smith G., Liu Y. Rabies glycoprotein virus-like particles (VLPs). 2012; WO/2012/061815.Trabelsi K., Ben Zakour M., Kallel H. Purification of rabies virus produced in Vero cells grown in serum free medium. Vaccine. 2019; 37(47):7052–60. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.072.Trabelsi K., Ben Zakour M., Kallel H. Purification of rabies virus produced in Vero cells grown in serum free medium. Vaccine. 2019; 37(47):7052–60. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.072.Targovnik A.M., Ferrari A., Mc Callum G.J., Arregui M.B., Smith I., Bracco L.F., Alfonso V., Lopez M.G., Martinez-Solis M., Herrero S., Miranda M.V. Highly efficient production of rabies vi- rus glycoprotein G ectodomain in Sf9 insect cells. 3 Biotech. 2019; 9(11):385. DOI: 10.1007/s13205-019-1920-4.Targovnik A.M., Ferrari A., Mc Callum G.J., Arregui M.B., Smith I., Bracco L.F., Alfonso V., Lopez M.G., Martinez-Solis M., Herrero S., Miranda M.V. Highly efficient production of rabies vi- rus glycoprotein G ectodomain in Sf9 insect cells. 3 Biotech. 2019; 9(11):385. DOI: 10.1007/s13205-019-1920-4.Sokol F., Kuwert E., Wiktor T.J., Hummeler K., Koprowski H. Purification of rabies virus grown in tissue culture. J. Virol. 1968; 2(8):836–49. DOI: 10.1128/JVI.2.8.836-849.1968.Sokol F., Kuwert E., Wiktor T.J., Hummeler K., Koprowski H. Purification of rabies virus grown in tissue culture. J. Virol. 1968; 2(8):836–49. DOI: 10.1128/JVI.2.8.836-849.1968.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins dur- ing the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins dur- ing the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.Ахмадеев Р.М., Ефимова М.А., Чернов А.Н., Мухамеджанова А.Г., Арсланова А.Ф., Шуралев Э.А., Хаертынов К.С., Никитин А.И., Макаев Х.Н. Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики. Патент РФ № 2694836. 14.12.2018, опубл. 17.07.2019. Бюл. № 20.Akhmadeev R.M., Efimova M.A., Chernov A.N., Mukhamedzhanova A.G., Arslanova A.F., Shuralev E.A., Khaertynov K.S., Nikitin A.I., Makaev Kh. N. [Method for obtaining rabies virus antigen for serological diagnostics]. Patent of the Russian Federation No. 2694836. 14.12.2018, publ. 17.07.2019. Bull. No. 20.Asenjo J.A., Andrews B.A. Aqueous two-phase sys- tems for protein separation: phase separation and applica- tions. J. Chromatogr. A. 2012; 18;1238:1–10. DOI: 10.1016/j.chroma.2012.03.049.Asenjo J.A., Andrews B.A. Aqueous two-phase sys- tems for protein separation: phase separation and applica- tions. J. Chromatogr. A. 2012; 18;1238:1–10. DOI: 10.1016/j.chroma.2012.03.049.Gaudin Y., Ruigrok R.W., Knossow M., Flamand A. Low‑pH conformational changes of rabies virus glycoprotein and their role in membrane fusion. J. Virol. 1993; 67(3):1365–72. DOI: 10.1128/JVI.67.3.1365-1372.1993.Gaudin Y., Ruigrok R.W., Knossow M., Flamand A. Low‑pH conformational changes of rabies virus glycoprotein and their role in membrane fusion. J. Virol. 1993; 67(3):1365–72. DOI: 10.1128/JVI.67.3.1365-1372.1993.Nadyrova A.I., Efimova M.A., Mukhamedzhanova A.G., Chernov A.N., Makaev H.N. Obtaining rabies virus purified an- tigen. As. J. Pharm. 2018; 12(4):1299–303. DOI: 10.22377/ajp.v12i04.2926.Nadyrova A.I., Efimova M.A., Mukhamedzhanova A.G., Chernov A.N., Makaev H.N. Obtaining rabies virus purified an- tigen. As. J. Pharm. 2018; 12(4):1299–303. DOI: 10.22377/ajp.v12i04.2926.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.