microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-2-94-100microbe-1697Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESЭкспериментальный пероксидазный конъюгат для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы в иммуноферментном анализеExperimental Peroxidase Conjugate for Detection of Specific Antibodies to Anthrax Agent in Enzyme Immunoassayhttps://orcid.org/0000-0002-3564-0791КурчеваС. А.KurchevaS. A.

Курчева Светлана Александровна

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

Svetlana A. Kurcheva

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

kurcheva@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8265-5128КурноскинаМ. М.KurnoskinaM. M.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8443-4089ЖарниковаИ. В.ZharnikovaI. V.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6617-9504КошкидькоА. Г.Koshkid’koA. G.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2229-6570РусановаД. В.RusanovaD. V.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5196-784XРязановаА. Г.RyazanovaA. G.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7744-3112АксеноваЛ. Ю.AksenovaL. Yu.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9366-5647КовалевД. А.KovalevD. A.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7698-7361ЖировА. М.ZhirovA. M.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9362-3949КуличенкоА. Н.KulichenkoA. N.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

 13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

stavnipchi@mail.ruФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»РоссияStavropol Research Anti-Plague InstituteRussian Federation2022120720220294100Copyright © Курчева С.А., Курноскина М.М., Жарникова И.В., Кошкидько А.Г., Русанова Д.В., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Куличенко А.Н., 20222022Курчева С.А., Курноскина М.М., Жарникова И.В., Кошкидько А.Г., Русанова Д.В., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Куличенко А.Н.Kurcheva S.A., Kurnoskina M.M., Zharnikova I.V., Koshkid’ko A.G., Rusanova D.V., Ryazanova A.G., Aksenova L.Y., Kovalev D.A., Zhirov A.M., Kulichenko A.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1697

Сибирская язва представляет собой актуальную проблему для ветеринарии и здравоохранения многих стран, включая Российскую Федерацию, что обусловливает необходимость совершенствования и разработки новых, чувствительных и специфичных диагностических средств.

Цель работы – создание экспериментального пероксидазного конъюгата для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы и оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа (ИФА).

Материалы и методы

Материалы и методы. Для конструирования пероксидазного конъюгата использовали пероксидазу хрена и белок А Staphylococcus aureus (Sigma-Aldrich, США). В качестве сенсибилизирующих агентов применяли бактериальные антигены, выделенные из штаммов Bacillus anthracis 55ΔТПА -1Spo, B. anthracis Sterne 34 F2. Разработанные экспериментальные серии конъюгата исследовали в ИФА на способность связывать антитела сывороток крови больных сибирской язвой и вакцинированных лиц. Чувствительность, специфичность и точность метода рассчитывали с помощью встроенных функций пакета ROCR.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Разработан пероксидазный конъюгат для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы при исследовании клинического материала, оптимизированы условия постановки ИФА. Для интерпретации результатов исследования использовали пороговое значение коэффициента позитивности, меньше которого результат считали отрицательным, а при равном или большем значении – положительным. В ходе испытания получены достоверные отличия в показателе «коэффициент позитивности» для групп «Здоровые»/«Больные» и «Здоровые»/«Вакцинированные», тогда как отличия между группами «Больные»/«Вакцинированные» были статистически незначимы. Максимальная точность метода наблюдалась при разведении сывороток крови 1:250 и 1:500. Установлена 100 % внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. Чувствительность и специфичность экспериментальных пероксидазных конъюгатов составила соответственно 100 и 95,8 %, а точность – 97,6 %.

Anthrax poses a pressing issue for veterinary medicine and public health in many countries, including the Russian Federation, which necessitates the improvement and development of new, sensitive and specific diagnostic tools.

The aim of the work was to create an experimental peroxidase conjugate for the detection of specific antibodies to the anthrax pathogen and to optimize the conditions for performing enzyme immunoassay (ELISA).

Materials and methods

Materials and methods. The peroxidase conjugate was constructed using horseradish peroxidase and Staphylococcus aureus protein A (Sigma-Aldrich, USA). Bacterial antigens isolated from strains of Bacillus anthracis 55ΔTPA-1Spo, B. anthracis Sterne 34 F2 were used as sensitizing agents. The developed experimental batches of the conjugate were tested in ELISA for the ability to bind antibodies in the blood sera of anthrax patients and vaccinated individuals. The sensitivity, specificity, and accuracy of the method were calculated using the built-in functions of the ROCR software package.

Results and discussion

Results and discussion. The peroxidase conjugate to detect specific antibodies to the anthrax pathogen in the study of clinical material has been developed; conditions for the ELISA performance have been optimized. To interpret the results of the study, a threshold value of the positivity coefficient was used, below which the result was considered negative, and at an equal or higher value, positive. The test demonstrated significant differences in the “positivity coefficient” indicator for the “Healthy”/“Sick” and “Healthy”/“Vaccinated” groups, while the differences between the “Sick”/“Vaccinated” groups were statistically insignificant. The maximum accuracy of the method was observed at blood serum dilutions of 1:250 and 1:500. 100 % intra-run, run-to-run and series-to-series reproducibility has been established for all positive samples. The sensitivity and specificity of the experimental peroxidase conjugates were 100 and 95.8 %, respectively, and the accuracy was 97.6 %.

диагностикасибирская язваантителаиФапероксидазный конъюгатdiagnosticsanthraxantibodiesELISAperoxidase conjugateReferencesPilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115– 25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115– 25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Koehler T.M. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol. Aspects Med. 2009; 30(6):386–96. DOI: 10.1016/j.mam.2009.07.004.Koehler T.M. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol. Aspects Med. 2009; 30(6):386–96. DOI: 10.1016/j.mam.2009.07.004.Chateau A., Van der Verren S.E., Remaut H., Fioravanti A. The Bacillus anthracis cell envelope: composition, physiological role, and clinical relevance. Microorganisms. 2020; 8(12):1864. DOI: 10.3390/microorganisms8121864.Chateau A., Van der Verren S.E., Remaut H., Fioravanti A. The Bacillus anthracis cell envelope: composition, physiological role, and clinical relevance. Microorganisms. 2020; 8(12):1864. DOI: 10.3390/microorganisms8121864.Pilo P., Frey J. Bacillus anthracis: molecular taxonomy, population genetics, phylogeny and patho-evolution. Infect. Genet. Evol. 2011; 11(6):1218–24. DOI: 10.1016/j.meegid.2011.05.013.Pilo P., Frey J. Bacillus anthracis: molecular taxonomy, po pulation genetics, phylogeny and patho-evolution. Infect. Genet. Evol. 2011; 11(6):1218–24. DOI: 10.1016/j.meegid.2011.05.013.Doganay M., Demiraslan H. Human anthrax as a re-emerging disease. Recent Pat. Anti-Infect. Drug Discov. 2015; 10(1):10–29. DOI: 10.2174/1574891x10666150408162354.Doganay M., Demiraslan H. Human anthrax as a re-emer gingdisease. Recent Pat. Anti-Infect. Drug Discov. 2015; 10(1):10–29. DOI: 10.2174/1574891x10666150408162354.Попова А.Ю., Куличенко А.Н., редакторы. Опыт ликвидации вспышки сибирской язвы на Ямале в 2016 году. Ижевск: Принт-2; 2017. 313 с.Popova A.Yu., Kulichenko A.N., editors. [Experience in Eradication of Anthrax Outbreak in Yamal in 2016]. Izhevsk: “Print-2”; 2017. 313 p.Аксенова Л.Ю., Рязанова А.Г., Жданова Е.В., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Тюменцева И.С., Коготкова О.И., Зуенко А.А., Куличенко А.Н. Разработка и апробация тест-системы для обнаружения антител к возбудителю сибирской язвы непрямым методом флуоресцирующих антител. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 4:76–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-4-76-78.Aksenova L.Yu., Ryazanova A.G., Zhdanova E.V., Tsygankova O.I., Buravtseva N.P., Eremenko E.I., Tyumentseva I.S., Kogotkova O.I., Zuenko A.A., Kulichenko A.N. [Construction and approval of the test-system for the detection of antibodies to anthrax agent using indirect fluorescent immunoassay]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; (4):76–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-4-76-78.Grundmann O. The current state of bioterrorist attack surveillance and preparedness in the US. Risk Manag. Healthc. Policy. 2014; 7:177–87. DOI: 10.2147/RMHP.S56047.Grundmann O. The current state of bioterrorist attack surveillance and preparedness in the US. Risk Manag. Healthc. Policy. 2014; 7:177–87. DOI: 10.2147/RMHP.S56047.Сысуев Е.Б., Поздняков А.М., Стрыгин А.В., Ираклионова Н .С. Основные принципы диагностики бактериальных поражений. Сибирская язва. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013; 7:95–6.Sysuev E.B., Pozdnyakov A.M., Strygin A.V., Iraklionova N.S. [Basic principles of diagnosis of bacterial lesions. Anthrax.] Mezhdunarodny Zhurnal Prikladnykh i Fundamental’nykh Issledo vaniy [International Journal of Applied and Basic Research]. 2013; (7):95–6.Marcus H., Danieli R., Epstein E., Velan B., Shafferman A., Reuveny S. Contribution of immunological memory to protective immunity conferred by a Bacillus anthracis protective antigenbased vaccine. Infect. Immun. 2004; 72(6):3471–7. DOI: 10.1128/IAI.72.6.3471-3477.2004.Marcus H., Danieli R., Epstein E., Velan B., Shafferman A., Reuveny S. Contribution of immunological memory to protective immunity conferred by a Bacillus anthracis protective antigenbased vaccine. Infect. Immun. 2004; 72(6):3471–7. DOI: 10.1128/ IAI.72.6.3471-3477.2004.Reuveny S., White M.D., Adar Y.Y., Kafri Y., Altboum Z., Gozes Y., Kobiler D., Shafferman A., Velan B. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine. Infect. Immun. 2001; 69(5):2888–93. DOI: 10.1128/IAI.69.5.2888-2893.2001.Reuveny S., White M.D., Adar Y.Y., Kafri Y., Altboum Z., Gozes Y., Kobiler D., Shafferman A., Velan B. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine. Infect. Immun. 2001; 69(5):2888–93. DOI: 10.1128/IAI.69.5.2888-2893.2001.Quinn C.P., Semenova V.A., Elie C.M., Romero-Steiner S., Greene C., Li H., Stamey K., Steward-Clark E., Schmidt D.S., Mothershed E., Pruckler J., Schwartz S., Benson R.F., Helsel L.O., Holder P.F., Johnson S.E., Kellum M., Messmer T., Thacker W.L., Besser L., Plikaytis B.D., Taylor T.H. Jr, Freeman A.E., Wallace K.J., Dull P., Sejvar J., Bruce E., Moreno R., Schuchat A., Lingappa J.R., Martin S.K., Walls J., Bronsdon M., Carlone G.M., Bajani-Ari M., Ashford D.A., Stephens D.S., Perkins B.A. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8(10):1103–10. DOI: 10.3201/eid0810.020380.Quinn C.P., Semenova V.A., Elie C.M., Romero-Steiner S., Greene C., Li H., Stamey K., Steward-Clark E., Schmidt D.S., Mothershed E., Pruckler J., Schwartz S., Benson R.F., Helsel L.O., Holder P.F., Johnson S.E., Kellum M., Messmer T., Thacker W.L., Besser L., Plikaytis B.D., Taylor T.H. Jr, Freeman A.E., Wallace K.J., Dull P., Sejvar J., Bruce E., Moreno R., Schuchat A., Lingappa J.R., Martin S.K., Walls J., Bronsdon M., Carlone G.M., Bajani-Ari M., Ashford D.A., Stephens D.S., Perkins B.A. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8(10):1103–10. DOI: 10.3201/eid0810.020380.Kingston J.J., Majumder S., Uppalapati S.R., Makam S.S., Urs R.M., Murali H.S., Batra H.V. Anthrax outbreak among cattle and its detection by extractable antigen 1 (EA1) based sandwich ELISA and immuno PCR. Indian J. Microbiol. 2015; 55:29–34. DOI: 10.1007/s12088-014-0494-4.Kingston J.J., Majumder S., Uppalapati S.R., Makam S.S., Urs R.M., Murali H.S., Batra H.V. Anthrax outbreak among cattle and its detection by extractable antigen 1 (EA1) based sandwich ELISA and immuno PCR. Indian J. Microbiol. 2015; 55:29–34. DOI: 10.1007/s12088-014-0494-4.Hassan J., Rahman M.B., Chowdhury S.M.Z.H., Rabidas S.K., Parvej M.S., Nazir K.N.H.N.H. ELISA based anthrax antibody titer in cattle induced by locally prepared anthrax vaccine originated from Sterne F-24 strain in Bangladesh. Microbes Health. 2015; 4(1):36–8. DOI: 10.3329/mh.v4i1.23104.Hassan J., Rahman M.B., Chowdhury S.M.Z.H., Rabidas S.K., Parvej M.S., Nazir K.N.H.N.H. ELISA based anthrax antibody titer in cattle induced by locally prepared anthrax vaccine originated from Sterne F-24 strain in Bangladesh. Microbes Health. 2015; 4(1):36–8. DOI: 10.3329/mh.v4i1.23104.Ghosh N., Goel A.K. Anti-protective antigen IgG enzymelinked immunosorbent assay for diagnosis of cutaneous anthrax in India. Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19(8):1238–42. DOI: 10.1128/CVI.00154-12.Ghosh N., Goel A.K. Anti-protective antigen IgG enzymelinked immunosorbent assay for diagnosis of cutaneous anthrax in India. Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19(8):1238–42. DOI: 10.1128/CVI.00154-12.Wilson M.B., Nakane P.K. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In: Knapp W., Holubar K., Wick G., editors. Immunofluorescence and Related Staining Techniques. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; 1978. P. 215–24.Wilson M.B., Nakane P.K. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In: Knapp W., Holubar K., Wick G., editors. Immunofluorescence and Related Staining Techniques. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; 1978. P. 215–24.Микшис Н.И., Попова П.Ю., Семакова А.П., Кудрявцева О.М., Бугоркова С.А., Кравцов А.Л. Изучение влияния антигенов, полученных из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis 55ΔTПА-1Spo-, на органы и ткани иммунизированных животных. Биотехнология. 2017; 33(5):45–60. DOI: 10.21519/0234-2758-2017-33-5-45-60.Mikshis N.I., Popova P.Yu., Semakova A.P., Kudryavtseva O.M., Bugorkova S.A., Kravtsov A.L. [Study of the effect of antigens obtained from the recombinant Bacillus anthracis 55ΔTPA1Spo-strain on the organs and tissues of immunized animals]. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2017; 33(5):45–60. DOI: 10.21519/0234-2758-2017-33-5-45-60.Горобец Е.А., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. Совершенствование способа получения иммунных кроличьих сибиреязвенных капсульно-соматических сывороток. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2008; 1:42–4.Gorobets E.A., Afanas’ev E.N., Tyumentseva I.S., Vasilenko N.F. [Improvement of the method for obtaining immune rabbit anthrax capsular-somatic sera]. Meditsinsky Vestnik Severnogo Kavkaza [Medical Bulletin of the North Caucasus]. 2008; (1):42–4.R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. [Электронный ресурс]. URL: https://www.R-project.org.R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. [Internet]. Available from: https://www.R-project.org.Wickham H., Averick M., Bryan J., Chang W., D’Agostino McGowan L., Francois R., Grolemund G., Hayes A., Henry L., Hester J., Kuhn M., Pedersen T.L., Miller E., Bache S.M., Muller K., Ooms J., Robinson D., Seidel D.P., Spinu V., Takahashi K., Vaughan D., Wilke C., Woo K., Yutani H. Welcome to the tidyverse. J. Open Source Softw. 2019; 4(43):1686. DOI: 10.21105/joss.01686.Wickham H., Averick M., Bryan J., Chang W., D’Agostino McGowan L., François R., Grolemund G., Hayes A., Henry L., Hester J., Kuhn M., Pedersen T.L., Miller E., Bache S.M., Müller K., Ooms J., Robinson D., Seidel D.P., Spinu V., Takahashi K., Vaughan D., Wilke C., Woo K., Yutani H. Welcome to the tidyverse. J. Open Source Softw. 2019; 4(43):1686. DOI: 10.21105/joss.01686.Sing T., Sander O., Beerenwinkel N., Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics. 2005; 21(20):3940–1. DOI: 10.1093/bioinformatics/bti623.Sing T., Sander O., Beerenwinkel N., Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics. 2005; 21(20):3940–1. DOI: 10.1093/bioinformatics/bti623.Alboukadel Kassambara (2020). ggpubr: ‘ggplot2’ Based Publication Ready Plots. [R package version 0.4.0]. [Электронный ресурс]. URL: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr.Alboukadel Kassambara (2020). ggpubr: ‘ggplot2’ Based Publication Ready Plots. [R package version 0.4.0]. [Internet]. Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr.Пономаренко Д.Г., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Логвиненко О.В., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Буравцева Н.П., Тюменцева И.С., Курчева С.А., Куличенко А.Н. Применение CAST-теста для оценки у людей специфической реактивности к возбудителю сибирской язвы. Медицинская иммунология. 2020; 22(5):1017–24. DOI: 10.15789/1563-0625-UCT-2058.Ponomarenko D.G., Rakitina E.L., Kostyuchenko M.V., Logvinenko O.V., Ryazanova A.G., Aksenova L.Yu., Buravtseva N.P., Tyumentseva I.S., Kurcheva S.A., Kulichenko A.N. [The use of the CAST test to assess human specific reactivity to anthrax agent]. Meditsinskaya Immunologiya [Medical Immunology]. 2020; 22(5):1017–24. DOI: 10.15789/1563-0625-UCT-2058.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.