microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-2-107-114microbe-1702Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка способа определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времениDevelopment of a Method for Determination of brucella suis Biovars Using Multilocus Real-time PCRhttps://orcid.org/0000-0003-0954-5683ОсинаН. А.OsinaN. A.

Осина Наталия Александровна

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

Natalia A. Osina

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2766-2624СитмбетовД. А.SitmbetovD. A.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4731-8089ДоманинаИ. В.DomaninaI. V.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruЛяшоваИ. В.LyashovaO. Yu.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1143-4069ЩербаковаС. А.ShcherbakovaS. A.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

https://orcid.org/0000-0002-4998-7673КасьянИ. А.Kas’yanI. A.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9828-3277КасьянЖ. А.Kas’yanZh. A.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2405-2684БулгаковаЕ. Г.BulgakovaE. G.

410005, Саратов, ул.Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20221307202202107114Copyright © Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Доманина И.В., Ляшова И.В., Щербакова С.А., Касьян И.А., Касьян Ж.А., Булгакова Е.Г., 20222022Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Доманина И.В., Ляшова И.В., Щербакова С.А., Касьян И.А., Касьян Ж.А., Булгакова Е.Г.Osina N.A., Sitmbetov D.A., Domanina I.V., Lyashova O.Y., Shcherbakova S.A., Kas’yan I.A., Kas’yan Z.A., Bulgakova E.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1702

Цель исследования – разработка методического подхода для определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Материалы и методы. В работе использовали 16 штаммов B. suis различных биоваров, по 2 шт. – B. neotomae и B. canis. Определение таксономической принадлежности штаммов бруцелл осуществляли по протоколам Bruce-ladder, Suis-ladder, БРУ-ДИФ. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRanner 6.5.52. Фрагментное секвенирование по Сэнгеру осуществляли на генетическом анализаторе 3500 XL в соответствии с рекомендациями производителя. Оценку гомологии нуклеотидных последовательностей проводили по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. Результаты и обсуждение. У штаммов B. suis различных биоваров проведен анализ структурной организации геномных островов IncP и GI-3. Установлено, что у штаммов 2, 4 биоваров B. suis и B. canis в результате гомологичной рекомбинации в геномном острове IncP утрачена концевая часть гена BRA0368, включающая 21 нуклеотид (повторяющийся в гене BRA0367) и стоп-кодон TAA, а также практически полностью последовательность гена BRA0367. Прямой повтор из 21 нуклеотида и стоп-кодона TGA гена BRA0367 заместил аналогичную область гена BRA0368, что привело к образованию делеции размером 185 п.н. В структуре GI-3 отличий у биоваров отмечено не было. Полученные результаты позволили разработать подход (Suis-ДИФ) для дифференциации биоваров B. suis, основанный на амплификации генов, расположенных в геномных островах IncP и GI-3, методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Подтверждена его специфичность при исследовании штаммов B. suis из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Проведенные исследования расширяют и дополняют сведения о генетической неоднородности видов и биоваров бруцелл. Предложенный способ определения биоваров B. suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени расширяет возможности идентификации бруцелл с помощью молекулярно-генетических методов.

The aim of the study was to develop a methodological approach to determination of Brucella suis biovars through multilocus PCR with real-time registration of results.

Materials and methods

Materials and methods. We used 16 strains of B. suis of various biovars, B. neotomae and B. canis – 2 strains of each. Determination of the taxonomic affiliation of Brucella strains was carried out according to the Bruce-ladder, Suis-ladder, BRU-DIF protocols. The selection of primers and probes was performed using the software on the website www.genscript.com and the GeneRanner 6.5.52 program. Fragment sequencing according to Sanger was performed on a 3500 XL genetic analyzer in accordance with the manufacturer’s recommendations. Nucleotide sequence homology was assessed using the BLAST algorithm and the GenBank NCBI database.

Results and discussion

Results and discussion. An analysis of the structural organization of IncP and GI-3 genomic islands has been carried out in B. suis strains of various biovars. It has been established that in strains of B. suis II, IV biovars and B. canis, the terminal part of the BRA0368 gene, comprising 21 nucleotides (repeated in the BRA0367 gene) and the “TAA” stop codon, as well as almost the entire sequence of the BRA0367 gene were lost, owing to homologous recombination in the IncP genome island. A 21-nucleotide direct repeat and the “TGA” stop codon of the BRA0367 gene replaced the analogous region of the BRA0368 gene which resulted in the deletion the size of 185 bp. No differences have been noted in the structure of GI-3 in biovars. The evidence obtained made it possible to develop the approach (SuisDIF) for differentiating B. suis biovars, based on the amplification of genes located in the IncP and GI-3 genomic islands using real-time PCR. Its specificity was confirmed in the study of B. suis strains from the fund of the State Collection of Pathogenic Bacteria of the Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. The conducted studies expand and supplement the data on the genetic heterogeneity of Brucella species and biovars. The proposed method for differentiating biovars of B. suis using multilocus PCR with real-time registration of results enhances the capacities for Brucella identification using molecular-genetic methods.

мультилокусная пцрвнутривидовая дифференциацияBrucella suisбиоварыгеномные острова IncP и GI-3структурная организацияфрагментное секвенирование по сэнгеруmultilocus PCRintraspecific differentiationBrucella suisbiovarsIncP and GI-3 genomic islandsstructural organizationSanger fragment sequencingReferencesКасьян Ж.А., Осина Н.А., Щербакова С.А. Разработка тест-системы для дифференциации видов бруцелл методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 3:47–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-47-51.Kas’yan Z.A., Osina N.A., Shcherbakova S.A. [Development of the test-system for differentiation of Brucella species, using real-time PCR]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (3):47–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-47-51.Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Marin C.M., de Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckaert A., Ferreira A.C., Cardoso R., Correa de Sa M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(10):3484–7. DOI: 10.1128/JCM.00837-08.López-Goñi I., García-Yoldi D., Marín C.M., de Miguel M.J., Muñoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckaert A., Ferreira A.C., Cardoso R., Corrêa de Sá M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(10):3484–7. DOI: 10.1128/JCM.00837-08.Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Marin C.M., de Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzman-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154(1–2):152–5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.López-Goñi I., García-Yoldi D., Marín C.M., de Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzmán-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154(1–2):152–5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1290–3. DOI: 10.1128/JCM.42.3.1290-1293.2004.Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1290–3. DOI: 10.1128/JCM.42.3.1290-1293.2004.Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V. Realtime detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis. Mol. Cell. Probes. 2001; 15(1):43–52. DOI: 10.1006/mcpr.2000.0338.Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V. Realtime detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis. Mol. Cell. Probes. 2001; 15(1):43–52. DOI: 10.1006/mcpr.2000.0338.Осина Н.А., Касьян Ж.А., Касьян И.А., Ляшова О.Ю., Осин А.В. Определение видовой принадлежности штаммов бруцелл из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» с помощью амплификационных и рестрикционных технологий. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 4:69–74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-69-74.Osina N.A., Kas’yan Z.A., Kas’yan I.A., Lyashova O.Yu., Osin A.V. [Determination of specific appurtenance of Brucella strains stored in the State Collection of Pathogenic Bacteria “Microbe”, using amplification and restriction techniques]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; (4):69–74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-69-74.Касьян Ж.А., Осина Н.А., Касьян И.А. Способ определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Патент РФ № RU2621864C1, опубл. 07.06.2017. Бюл. № 16.Kas’yan Zh.A., Osina N.A., Kas’yan I.A. [A method for determining the specific appurtenance of the brucellosis agent using PCR with hybridization-fluorescence registration of results in real-time mode]. RF patent No. RU2621864C1, publ. 06/07/2017.Bull. No. 16.Mancilla M. The Brucella genomic islands. In Brucella: Molecular Microbiology and Genomics. Lopez-Goni I., O’Callaghan D., editors. Norfolk, UK: Caister Academic Press; 2012. P. 36–57. DOI: 10.21775/9781913652531.Mancilla M. The Brucella genomic islands. In Brucella: Molecular Microbiology and Genomics. López-Goñi I., O’Callaghan D., editors. Norfolk, UK: Caister Academic Press; 2012. P. 36–57. DOI: 10.21775/9781913652531.Paulsen I.T., Seshadri R., Nelson K.E., Eisen J.A., Heidelberg J.F., Read T.D., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L.M., Beanan M.J., Daugherty S.C., Deboy R.T., Durkin A.S., Kolonay J.F., Madupu R., Nelson W.C., Ayodeji B., Kraul M., Shetty J., Malek J., Van Aken S.E., Riedmuller S., Tettelin H., Gill S.R., White O., Salzberg S.L., Hoover D.L., Lindler L.E., Halling S.M., Boyle S.M., Fraser C.M. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(20):13148–53. DOI: 10.1073/pnas.192319099.Paulsen I.T., Seshadri R., Nelson K.E., Eisen J.A., Heidelberg J.F., Read T.D., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L.M., Beanan M.J., Daugherty S.C., Deboy R.T., Durkin A.S., Kolonay J.F., Madupu R., Nelson W.C., Ayodeji B., Kraul M., Shetty J., Malek J., Van Aken S.E., Riedmuller S., Tettelin H., Gill S.R., White O., Salzberg S.L., Hoover D.L., Lindler L.E., Halling S.M., Boyle S.M., Fraser C.M. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(20):13148–53. DOI: 10.1073/pnas.192319099.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.