microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-3-151-157microbe-1737Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСравнительный анализ экспрессии основных генов вирулентности у различных штаммов Vibrio сholerae О1Comparative Analysis of Expression of the Main Virulence Genes in Various Vibrio cholerae О1 Strainshttps://orcid.org/0000-0001-5759-3765ЧелдышоваН. Б.CheldyshovaN. B.

Челдышова Надежда Борисовна

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Nadezhda B. Cheldyshova

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruДевдарианиЗ. Л.DevdarianiZ. L.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20223010202203151157Copyright © Челдышова Н.Б., Девдариани З.Л., 20222022Челдышова Н.Б., Девдариани З.Л.Cheldyshova N.B., Devdariani Z.L.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1737

Цель – сравнительное изучение экспрессии основных генов вирулентности у штаммов Vibrio cholerae классического биовара, типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор.

Материалы и методы

Материалы и методы. В качестве модельных использовали природные токсигенные штаммы V. cholerae О1 классического биовара (J89, Пакистан, 1969 г.), типичного (М-887, Астрахань, 1970 г.) и генетически измененного (301, Таганрог, 2011 г.) штаммов биовара Эль Тор. Штаммы выращивали в оптимальных для продукции холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей условиях. Исследование роста штаммов проводили на бульоне LB при комнатной температуре с определением количества клеток на спектрофотометре Biowave DNA (Biochrome Ltd., Великобритания). Определение экспрессии генов осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Изучена экспрессия структурных (ctxA, tcpA) и регуляторных (toxR, toxT, tcpP, tcpH) генов вирулентности у штаммов холерного вибриона классического биовара, типичного и генетически измененного штаммов биовара Эль Тор. Выявлены значительные различия по времени и уровню максимальной экспрессии указанных генов у штаммов классического и Эль Тор биоваров. Установлено, что экспрессия генов ctxA и toxR у штамма геноварианта достигала своего максимума на 1–3 ч раньше других штаммов. При этом уровень экспрессии гена ctxA соответствовал уровню классического штамма. Максимальная экспрессия гена toxR у штамма геноварианта была выше, чем у типичного Эль Тор и классического штаммов, а также имела четкую обратную корреляцию с экспрессией гена ctxA. Экспрессия генов tcpA, toxT и tcpH у штамма классического биовара достигала максимума на 1–2 ч раньше, чем у штаммов биовара Эль Тор. Указанные различия следует учитывать при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением экспрессии основных генов вирулентности.

The aim of the work was a comparative study of the expression of the main virulence genes in Vibrio cholerae strains of the classical biovar, typical and genetically modified strains of V. cholerae, El Tor biovar.

Materials and methods

Materials and methods. Natural toxigenic strains of V. cholerae O1, classical biovar (J89, Pakistan, 1969), typical (M-887, Astrakhan, 1970) and genetically modified (301, Taganrog, 2011) strains of the El Tor biovar were used as model ones. The strains were grown under optimum conditions for the production of cholera toxin and toxin-coregulated pili. The assessment of strain growth was carried out in LB broth at room temperature with determination of the cells number on a Biowave DNA spectrophotometer (Biochrome Ltd., UK). Determination of gene expression was performed using real-time PCR with reverse transcription.

Results and discussion

Results and discussion. The expression of structural (ctxA, tcpA) and regulatory (toxR, toxT, tcpP, tcpH) virulence genes has been investigated in V. cholerae strains of the classical biovar, typical and genetically modified strains of the El Tor biovar. Significant differences have been revealed in terms of time and level of maximum expression of these genes in strains of classical and El Tor biovars. It was found that ctxA and toxR genes expression in the genovariant strain reached its maximum 1–3 h earlier than in the other strains. At the same time, the level of ctxA gene expression corresponded to the level of the classical strain. The maximum expression of the toxR gene in the genovariant strain was higher than in typical El Tor and classical strains, and also had a clear inverse correlation with ctxA gene expression. Expression of the tcpA, toxT, and tcpH genes in the classical biovar strain reached its maximum 1–2 h earlier than in the El Tor biovar strains. These differences should be taken into account when conducting research work related to the study of the expression of the main virulence genes.

холерный вибрионгеновариантыэкспрессия генов вирулентностиVibrio choleraegenovariantsexpression of virulence genesReferencesKaraolis D.K., Somara S., Maneval D.R. Jr., Johnson J.A., Kaper J.B. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria. Nature. 1999; 399(6734):375–9. DOI: 10.1038/20715.Karaolis D.K., Somara S., Maneval D.R. Jr., Johnson J.A., Kaper J.B. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a typeIV pilus and a phage receptor in cholera bacteria. Nature. 1999; 399(6734):375–9. DOI: 10.1038/20715.Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителей холеры. Генетика. 2013; 49(9):1036–47. DOI: 10.7868/S0016675813090087.Smirnova N.I., Zadnova S.P., Agafonov D.A., Shashkova A.V., Cheldyshova N.B., Cherkasov A.V. [Comparative molecular-genetic analysis of mobile elements of natural strains of cholera pathogens]. Genetika [Genetics]. 2013; 49(9):1036–47. DOI: 10.7868/S0016675813090087.Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Кульшань Т.А., Щелканова Е.Ю., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Влияние делеции профага СТХφ возбудителя холеры на экспрессию регуляторных генов, контролирующих вирулентность и образование биопленки. Генетика. 2017; 53(3):284–97. DOI: 10.7868/S0016675817020114.Smirnova N.I., Agafonov D.A., Kul’shan’ T.A., Shchelkanova E.Yu., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. [Effect of deletion of the CTXφ prophage of the cholera causative agent on the expression of regulatory genes that control virulence and biofilm formation]. Genetika [Genetics]. 2017; 53(3):284–97. DOI: 10.7868/S0016675817020114.DiRita V.J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J.J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991; 88(12):5403–7. DOI: 10.1073/pnas.88.12.5403.DiRita V.J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J.J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991; 88(12):5403–7. DOI: 10.1073/pnas.88.12.5403.Hase C.C., Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998; 95(2):730–4. DOI: 10.1073/pnas.95.2.730.Hase C.C., Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998; 95(2):730–4. DOI: 10.1073/pnas.95.2.730.Krukonis E.S., Yu R.R., Dirita V.J. The Vibrio cholerae ToxR/ TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter. Mol. Microbiol. 2000; 38(1):67–84. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2000.02111.x.Krukonis E.S., Yu R.R., Dirita V.J. The Vibrio cholerae ToxR/ TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-loca¬ lized transcriptional activators on a single promoter. Mol. Microbiol. 2000; 38(1):67–84. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2000.02111.x.Li N., Zheng Y., Shi M., Xue Y., Zhang T., Ji S., Yang M. TcpP L152A constitutively activating virulence gene expression in Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 2019; 76(5):583–9. DOI: 10.1007/s00284-019-01659-y.Li N., Zheng Y., Shi M., Xue Y., Zhang T., Ji S., Yang M. TcpP L152A constitutively activating virulence gene expression in Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 2019; 76(5):583–9. DOI: 10.1007/s00284-019-01659-y.Hung D.T., Mekalanos J.J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(8):3028–33. DOI: 10.1073/pnas.0409559102.Hung D.T., Mekalanos J.J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(8):3028–33. DOI: 10.1073/pnas.0409559102.Kovacikova G., Skorupski K. Differential activation of the tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2000; 182(11):3228– 38. DOI: 10.1128/JB.182.11.3228-3238.2000.Kovacikova G., Skorupski K. Differential activation of the tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2000; 182(11):3228– 38. DOI: 10.1128/JB.182.11.3228-3238.2000.Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.С. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46–54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.С. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46–54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitali¬ zed patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Safa A., Sultana J., Dac Cam P., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 hybrid El Tor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14(6):987–8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.Safa A., Sultana J., Dac Cam P., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 hybrid El Tor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14(6):987–8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.Носков А.К., Кругликов В.Д., Москвитина Э.А., Монахова Е.В., Левченко Д.А., Янович Е.Г., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Непомнящая Н.Б., Ежова М.И., Подойницына О.А. Характеристика эпидемиологической ситуации по холере в мире и в Российской Федерации в 2020 г. и прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:43–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-43-51.Noskov A.K., Kruglikov V.D., Moskvitina E.A., Monakhova E.V., Levchenko D.A., Yanovich E.G., Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Nepomnyashchaya N.B., Ezhova M.I., Podoinitsyna O.A. [Characteristics of the epidemiological situation on cholera in the world and in the Russian Federation in 2020 and forecast for 2021]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; (1):43–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-43-51.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.Grim C.J., Choi J., Chun J., Jeon Y.-S., Taviani E., Hasan N.A., Haley B., Huq A., Colwell R.R. Occurrence of the Vibrio cholerae seventh pandemic VSP-I island and a new variant. OMICS. 2010; 14(1):1–7. DOI: 10.1089/omi.2009.0087.Grim C.J., Choi J., Chun J., Jeon Y.-S., Taviani E., Hasan N.A., Haley B., Huq A., Colwell R.R. Occurrence of the Vibrio chole¬ rae seventh pandemic VSP-I island and a new variant. OMICS. 2010; 14(1):1–7. DOI: 10.1089/omi.2009.0087.Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.-M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S.G., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211–3. DOI: 10.1128/JCM.01304-06.Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.-M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S.G., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211–3. DOI: 10.1128/JCM.01304-06.Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 2006; 74(6):3633–42. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 2006; 74(6):3633–42. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.DiRita V.J., Neely M., Taylor R.K., Bruss P.M. Differential expression of the ToxR regulon in classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae is due to biotype – specific over tox T expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93(15):7991–5. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.DiRita V.J., Neely M., Taylor R.K., Bruss P.M. Differential expression of the ToxR regulon in classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae is due to biotype – specific over tox T expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93(15):7991–5. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. Regulation and temporal expression patterns of Vibrio cholerae virulence genes during infection. Cell. 1999; 99(6):625–34. DOI: 10.1016/s0092-8674(00)81551-2.Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. Regulation and temporal expression patterns of Vibrio cholerae virulence genes during infection. Cell. 1999; 99(6):625–34. DOI: 10.1016/s00928674(00)81551-2.Murley Y.M., Behari J., Griffin R., Calderwood S.B. Classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae differ in timing of transcription of tcpPH during growth in inducing conditions. Infect. Immun. 2000; 68(5):3010–4. DOI: 10.1128/IAI.68.5.30103014.2000.Murley Y.M., Behari J., Griffin R., Calderwood S.B. Classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae differ in timing of transcription of tcpPH during growth in inducing conditions. Infect. Immun. 2000; 68(5):3010–4. DOI: 10.1128/IAI.68.5.30103014.2000.Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Тучков И.В., Смирнова Н.И. Разработка алгоритма определения уровня экспрессии генов ctxА и toxR Vibrio cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационнофлуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 3:53–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-53-57.Kritsky A.A., Cheldyshova N.B., Tuchkov I.V., Smirnova N.I. [Development of the algorithm for identification of the level of Vibrio cholerae ctxA and toxR gene expression using RT-PCR with real-time hybridization-fluorescent registration of results]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 3:53–7. DOI: 10.21055/0370-10692017-3-53-57.Fykse E.M., Skogan G., Davies W., Olsen J.S., Blatny J.M. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequencebased amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(5):1457–66. DOI: 10.1128/AEM.01635-06.Fykse E.M., Skogan G., Davies W., Olsen J.S., Blatny J.M. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequencebased amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(5):1457–66. DOI: 10.1128/AEM.01635-06.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt method. Methods. 2001; 25(4):402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt method. Methods. 2001; 25(4):402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во Саратовского университета; 1984. 328 с.Adamov A.K., Naumshina M.S. [Cholera Vibrios]. Saratov: Publishing House of the Saratov University; 1984. 328 p.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.