Предложено два варианта нового метода, оптимизирующего условия получения и очистки ЛПС из штаммов Y. pestis , а также позволяющего исключить применение ядовитых и трудноудаляемых реактивов, упростить и удешевить методику, рационально утилизировать отходы производства. Метод включает предварительную водносолевую экстракцию бактерий для удаления легкорастворимых веществ с последующим разрушением их ультразвуком в лизирующем буфере (0,1 М Трис-HCl, рН 8,0; 10 ммоль ЭДТА, 1 % Тритон Х-100). Для депротеинизации неочищенного эндотоксина в первом случае используется коммерческая протеиназа К (Sigma), а во втором - ферментный комплекс протеовибрин, выделенный из отхода производства вакцины холерной бивалентной химической. Для очистки ЛПС от нуклеиновых кислот введена процедура подкисления образца ледяной уксусной кислотой до рН 3,2-3,4. Варианты способа позволяют улучшить качество препаратов ЛПС относительно метода-прототипа и получать эндотоксин возбудителя чумы, практически не отличающийся по физико-химической характеристике, гомогенности, иммунохимической активности и специфичности от антигена, полученного классической водно-фенольной экстракцией по О.Westphal.
Put forward are two alternatives of a new method for optimization of conditions of LPS obtaining and purification from Y. pestis strains; as well as for avoiding application of poisonous and hard-to-remove reagents; for simplification and cost-cutting of the technique; and for rationalization of production waste management. This method involves preliminary salt-water extraction of bacteria, for elimination of easy-dissolving substances, with the subsequent fracturing using ultrasound in lysing buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0; 10 mmol of EDTA, 1 % Triton X-100). The first alternative for deproteinization of non-purified endotoxin is the commercial preparation of proteinase K (Sigma), the second one - an enzyme complex - proteovibrin, isolated from waste material accumulated in the process of cholera chemical bivalent vaccine production. Apart from this, introduced has been a phase of sample acidification by applying glacial acetic acid up to pH 3,2-3,4 to decontaminate LPS from nucleic acids. These two variations of the method provide for enhancement of LPS preparation quality as compared to prototype method, and for obtainment of plague agent endotoxin that is hardly distinguishable in physical-chemical properties, homogeneity, immunochemical activity and specificity from the antigen, manufactured by means of water-phenol extraction following Westphal O. technique.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.