microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-3-170-172microbe-1740Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯBRIEF COMMUNICATIONSДетекция Bacillus anthracis по генам профага lambda_Ba03 посредством ПЦР в реальном времениReal-Time PCR Detection of Bacillus anthracis by Lambda_Ba03 Prophage Geneshttps://orcid.org/0000-0002-1597-7207НизкородоваА. С.NizkorodovaA. S.

Низкородова Анна Сергеевна

050012, Алма-Ата; 

050054, Алма-Ата

Anna S. Nizkorodova

Almaty, 050054, 

Almaty, 050054

a.nizkorodova@imbb.org.kzhttps://orcid.org/0000-0001-9198-695XМальцеваЭ. Р.Mal’tsevaE. R.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0003-0379-2472БердыгуловаЖ. А.BerdygulovaZh. A.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-0606-4289НайзабаеваД. А.NaizabaevaD. A.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-1091-0150КуатбековаС. А.KuatbekovaS. A.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-9646-033XЖигайловА. В.ZhigailovA. V.

050012, Алма-Ата; 

050054, Алма-Ата

 

Almaty, 050054,

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-4769-7824АбдоллаН.AbdollaN.

050012, Алма-Ата; 

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054,

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-9516-5566МашжанА. С.MashzhanA. S.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-6219-4002АхметоллаевИ. А.AkhmetollaevI. A.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0003-4895-1473СкибаЮ. А.SkibaYu. A.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

https://orcid.org/0000-0002-7767-0251МамадалиевС. М.MamadalievS. M.

050054, Алма-Ата

Almaty, 050054

РГП «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина»; Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии»КазахстанInstitute of Molecular Biology and Biochemistry named after M.A. Aitkhozhin; Almaty Branch of the National Center for BiotechnologyKazakhstanФилиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии»КазахстанAlmaty Branch of the National Center for BiotechnologyKazakhstan20223010202203170172Copyright © Низкородова А.С., Мальцева Э.Р., Бердыгулова Ж.А., Найзабаева Д.А., Куатбекова С.А., Жигайлов А.В., Абдолла Н., Машжан А.С., Ахметоллаев И.А., Скиба Ю.А., Мамадалиев С.М., 20222022Низкородова А.С., Мальцева Э.Р., Бердыгулова Ж.А., Найзабаева Д.А., Куатбекова С.А., Жигайлов А.В., Абдолла Н., Машжан А.С., Ахметоллаев И.А., Скиба Ю.А., Мамадалиев С.М.Nizkorodova A.S., Mal’tseva E.R., Berdygulova Z.A., Naizabaeva D.A., Kuatbekova S.A., Zhigailov A.V., Abdolla N., Mashzhan A.S., Akhmetollaev I.A., Skiba Y.A., Mamadaliev S.M.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1740

Цель исследования – разработка набора праймеров и флуоресцентных зондов для детекции двух хромосомных мишеней Bacillus anthracis методом ПЦР в реальном времени на основе генов профага lambda_Ba03.

Материалы и методы

Материалы и методы. При BLAST-анализе хромосомной ДНК B. anthracis в качестве мишеней определены два гена профага lambdaBa03: BA_5358 (AE016879.1: 4852332..4853642) и BA_5361 (AE016879.1: 4855298..4856278). Разработанные праймеры и флуоресцентные гидролизуемые пробы TaqMan для одновременной детекции хромосомной ДНК B. anthracis по двум указанным генам проверены в реакциях ПЦР в реальном времени на чувствительность и специфичность.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Проведенные исследования на образцах хромосомной ДНК близкородственных бактерий (B. cereus, B. thuringiensis, B. subtilis, B. clausii) показали 100 % специфичность разработанных сетов праймеров/зондов. Чувствительность разработанного мультиплексного набора, исследованная на образцах ДНК вакцинного штамма м55‑ВНИИВВиМ и архивных образцах ДНК B. anthracis, составила 100 фг бактериальной ДНК, что в пересчете определяет предел чувствительности в 16,72 бактериального генома на реакцию. Разработанный мультиплексный набор позволяет использовать его как отдельный инструмент для исследовательских лабораторий, изучающих сибирскую язву.

The aim of the study was to develop a set of primers and fluorescent probes for the detection of two chromosomal targets of Bacillus anthracis using real-time PCR based on the lambda_Ba03 prophage genes.

Materials and methods

Materials and methods. BLAST analysis of B. anthracis chromosomal DNA identified two target genes in the region of lambdaBa03 prophage, BA_5358 (AE016879.1: 4852332..4853642) and BA_5361 (AE016879.1: 4855298..4856278). The designed primers and fluorescent hydrolysable TaqMan probes for simultaneous detection of B. anthracis chromosomal DNA by two stated genes were tested in qPCR for sensitivity and specificity.

Results and discussion

Results and discussion. Studies performed on chromosomal DNA samples of closely related bacteria (B. cereus, B. thuringiensis, B. subtilis, B. clausii) have shown 100 % specificity of the developed sets of primers/probes. The sensitivity of the devised multiplex kit, tested on DNA samples of the m55-VNIIVViM vaccine strain and archival DNA samples of B. anthracis, reached 100 fg of bacterial DNA, which sets the limit of sensitivity at 17 genomes per reaction. The developed multiplex kit can be used as a separate tool for research laboratories studying anthrax.

Bacillus anthracisПЦР в реальном времениlambdaBA_5358lambdaBA_5361сибирская язваBacillus anthracisreal-time PCRlambdaBA_5358lambdaBA_5361anthraxФинансирование. Проведенное исследование осуществлялось в рамках программы BR10764975 Министерства сельского хозяйства Республики КазахстанReferencesKoehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a transacting element activate transcription from one of two promoters. J. Bacteriol. 1994; 3:586–95. DOI: 10.1128/jb.176.3.586-595.1994.Koehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a transacting element activate transcription from one of two promoters. J. Bacteriol. 1994; 3:586–95. DOI: 10.1128/jb.176.3.586-595.1994.Goel A.K. Anthrax: A disease of biowarfare and public health importance. World J. Clin. Cases. 2015; 1:20–33. DOI: 10.12998/wjcc.v3.i1.20.Goel A.K. Anthrax: A disease of biowarfare and public health importance. World J. Clin. Cases. 2015; 1:20–33. DOI: 10.12998/wjcc.v3.i1.20.Ezzell J.W., Welkos S.L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. J. Appl. Microbiol. 1999; 2:250–67. DOI: 10.1046/j.13652672.1999.00881.x.Ezzell J.W., Welkos S.L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. J. Appl. Microbiol. 1999; 2:250–67. DOI: 10.1046/j.13652672.1999.00881.x.Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolstø A.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 6:2627–30. DOI: 10.1128/AEM.66.6.2627-2630.2000.Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolstø A.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 6:2627–30. DOI: 10.1128/AEM.66.6.2627-2630.2000.Pannucci J., Okinaka R.T., Sabin R., Kuske C.R. Bacillus anthracis pXO1 plasmid sequence conservation among closely related bacterial species. J. Bacteriol. 2002; 1:134–41. DOI: 10.1128/JB.184.1.134-141.2002.Pannucci J., Okinaka R.T., Sabin R., Kuske C.R. Bacillus anthracis pXO1 plasmid sequence conservation among closely related bacterial species. J. Bacteriol. 2002; 1:134–41. DOI: 10.1128/JB.184.1.134-141.2002.Van der Auwera G.A., Andrup L., Mahillon J. Conjugative plasmid pAW63 brings new insights into the genesis of the Bacillus anthracis virulence plasmid pXO2 and of the Bacillus thuringiensis plasmid pBT9727. BMC Genomics. 2005; 6:103. DOI: 10.1186/14712164-6-103.Van der Auwera G.A., Andrup L., Mahillon J. Conjugative plasmid pAW63 brings new insights into the genesis of the Bacillus anthracis virulence plasmid pXO2 and of the Bacillus thuringiensis plasmid pBT9727. BMC Genomics. 2005; 6:103. DOI: 10.1186/14712164-6-103.Ågren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundström A., Segerman B., Koene M., Löfström C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 8:671–85. DOI: 10.4161/viru.26288.Ågren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundström A., Segerman B., Koene M., Löfström C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 8:671–85. DOI: 10.4161/viru.26288.Shevtsov A., Lukhnova L., Izbanova U., Vernadet J.-P., Kuibagarov M., Amirgazin A., Ramankulov Y., Vergnaud G. Bacillus anthracis phylogeography: new clues from Kazakhstan, Central Asia. Front. Microbiol. 2021; 12:778225. DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225.Shevtsov A., Lukhnova L., Izbanova U., Vernadet J.-P., Kuibagarov M., Amirgazin A., Ramankulov Y., Vergnaud G. Bacillus anthracis phylogeography: new clues from Kazakhstan, Central Asia. Front. Microbiol. 2021; 12:778225. DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225.Nossa C.W., Oberdorf W.E., Yang L., Aas J.A., Paster B.J., Desantis T.Z., Brodie E.L., Malamud D., Poles M.A., Pei Z. Design of 16S rRNA gene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome. World J. Gastroenterol. 2010; 16(33):4135–44. DOI: 10.3748/wjg.v16.i33.4135.Nossa C.W., Oberdorf W.E., Yang L., Aas J.A., Paster B.J., Desantis T.Z., Brodie E.L., Malamud D., Poles M.A., Pei Z. Design of 16S rRNA gene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome. World J. Gastroenterol. 2010; 16(33):4135–44. DOI: 10.3748/wjg.v16.i33.4135.McKiernan H.E., Danielson P.B. Molecular Diagnostic Applications in Forensic Science. In: Patrinos G.P., editor. Molecular Diagnostics (3d edition). Academic Press; 2017. Р. 371–94. DOI: 10.1016/B978-0-12-802971-8.00021-3.McKiernan H.E., Danielson P.B. Molecular Diagnostic Applications in Forensic Science. In: Patrinos G.P., editor. Molecular Diagnostics (3d edition). Academic Press; 2017. Р. 371–94. DOI: 10.1016/B978-0-12-802971-8.00021-3.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.