microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2022-4-69-74microbe-1763Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПрямое количественное определение белковых антигенов в препаратах субъединичных чумных и риккетсиозных вакцинDirect Quantification of Protein Antigens in Subunit Plague and Rickettsial Vaccine Preparationshttps://orcid.org/0000-0003-1345-2033КопыловП. Х.KopylovP. Kh.

Копылов Павел Христофорович

Российская Федерация, 142279, р.п. Оболенск

Pavel Kh. Kopylov

Obolensk, 142279, Russian Federation

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0002-1996-8949ДентовскаяС. В.DentovskayaS. V.

Российская Федерация, 142279, р.п. Оболенск

Obolensk, 142279, Russian Federation

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»РоссияState Scientific Center of Applied Microbiology and BiotechnologyRussian Federation202211022023046974Copyright © Копылов П.Х., Дентовская С.В., 20232023Копылов П.Х., Дентовская С.В.Kopylov P.K., Dentovskaya S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1763

Цель работы – предложить методические приемы прямого количественного определения специфических белковых антигенов Yersinia pestis и Rickettsia raoultii в препаратах и различных прототипах субъединичных вакцин. Материалы и методы. В качестве модельных использовали антигены Y. pestis LcrV и Caf1, заключенные в субстанцию вакцины чумной молекулярной микроинкапсулированной (ВЧММ ) и раздельно, в микрокристаллы аминокислот, соосажденных с белками чумного микроба. Антигены R. raoultii Adr2, OmpB24, YbgF адсорбировали прототипом субстанции риккетсиозной вакцины. Освобождение чумных антигенов из микрокапсул ВЧММ проводили последовательной обработкой последних органическими растворителями метиленхлоридом и метанолом соответственно, микрокристаллы-носители растворяли 0,1 М натрий-цитратным буфером, рН 6,0. Антигены в прототипе субстанции риккетсиозной вакцины определяли измерением количества белков, не связывающихся с алюмогелем. Количественные параметры, характеризующие содержание антигенов в субстанциях и прототипах вакцинных препаратов, вычисляли в результате обработки цифровых изображений полиакриламидных гелей, полученных электрофорезом фракций белковых антигенов, экстрагированных из носителей. Результаты и обсуждение. Изучены не вызывающие деградацию белка способы прямой экстракции и последующего количественного анализа антигенов Y. pestis LcrV и Caf1 из препаратов субъединичных вакцин на основе микрокристаллов аминокислот и полилактидных микрокапсул. Установлен различный характер связывания LcrV и Caf1 в субстанциях микрокристаллов, при этом количественно определена доля антигенов, освобождающихся из микрокристаллов только в результате их полного растворения. Выявлено, что при низких концентрациях белков LcrV и Caf1, экстрагированных из микрокристаллов, для их уверенной визуализации необходимо концентрирование экстрактов с последующим удалением солей. Подтверждено, что 10 мкг чумных антигенов и белков R. raoultii в объеме дозы введения 200 мкл суспензии достаточно для количественного анализа электрофоретическим методом. Обсуждаются перспективы альтернативных прямой экстракции антигенов иных физико-химических методов оценки состава и качества вакцинных препаратов.

The aim of the work was to put forward the methods for direct quantitative determination of the content of Yersinia pestis and Rickettsia raoultii protein antigens in preparations and various prototypes of subunit vaccines. Materials and methods. Y. pestis LcrV and Caf1 antigens enclosed in the substance of the molecular microencapsulated plague vaccine (MMPV) and separately, in microcrystals of amino acids co-precipitated with plague proteins were used as model antigens. R. raoultii Adr2, OmpB24, and YbgF antigens were adsorbed on the prototype substance of the rickettsia vaccine. The release of plague antigens from MMPV microcapsules was carried out through successive treatment of the latter with organic solvents, methylene chloride and methanol, respectively; the carrier microcrystals were dissolved in 0.1 M sodium citrate buffer at pH 6.0. The antigen content in the prototype substance of the rickettsial vaccine was determined by measuring the amount of proteins not bound to the alumogel. Quantitative parameters characterizing the content of antigens in the substances and prototypes of vaccine preparations were calculated by processing digital images of polyacrylamide gels obtained by electrophoresis of protein antigen fractions extracted from carriers. Results and discussion. Methods for direct extraction and subsequent quantitative analysis of Y. pestis LcrV and Caf1 antigens from subunit vaccine preparations based on amino acid microcrystals and polylactide microcapsules that do not cause protein degradation have been studied. A different nature of the binding of LcrV and Caf1 in the substances of microcrystals has been established, while the proportion of antigens released from microcrystals has been quantified only in case of their complete dissolution. It was found that at low concentrations of LcrV and Caf1 proteins extracted from microcrystals, it is necessary to concentrate the extracts with subsequent removal of salts for their reliable visualization. It has been confirmed that 10 μg of plague antigens and proteins of R. raoultii in a dose volume of 200 μl of suspension is sufficient for quantitative analysis using electrophoretic method. The prospects of other physicochemical methods alternative to direct extraction of antigens for evaluating the composition and quality of vaccine preparations are discussed.

вакциныадъювантыYersinia pestisLcrVCaf1микрокристаллыэкстракцияRickettsia raoultiiAdr2OmpB24YbgF.vaccinesadjuvantsYersinia pestisLcrVCaf1microcrystalsextractionRickettsia raoultiiAdr2OmpB24YbgFРабота выполнена в рамках отраслевой научно- исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиоло‑ гического надзора и санитарной охраны террито‑ рии Российской Федерации. Создание новых техно‑ логий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней».ReferencesBenne N., van Duijn J., Kuiper J., Jiskoot W., Slütter B. Orchestrating immune responses: How size, shape and rigidity affect the immunogenicity of particulate vaccines. J. Control Release. 2016; 234:124–34. DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.05.033.Benne N., van Duijn J., Kuiper J., Jiskoot W., Slütter B. Orchestrating immune responses: How size, shape and rigidity affect the immunogenicity of particulate vaccines. J. Control Release. 2016; 234:124–34. DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.05.033.Baranov M.V., Kumar M., Sacanna S., Thutupalli S., van den Bogaart G. Modulation of immune responses by particle size and shape. Front. Immunol. 2021; 11:607945. DOI: 10.3389/fimmu.2020.607945.Baranov M.V., Kumar M., Sacanna S., Thutupalli S., van den Bogaart G. Modulation of immune responses by particle size and shape. Front. Immunol. 2021; 11:607945. DOI: 10.3389/fimmu.2020.607945.Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4. М.; 2018. С. 5326–36.[State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. XIV edition. Vol. 4. Moscow; 2018. P. 5326–36.Воробьева С.А., Дуракова О.С., Громова О.В., Волох О.А., Клокова О.Д., Никифоров А.К. Антигенные компоненты холерной бивалентной химической вакцины, методы их выделения и контроля. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 2:12–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-12-19.Vorob’eva S.A., Durakova O.S., Gromova O.V., Volokh O.A., Klokova O.D., Nikiforov A.K. [Antigenic components of chemical bivalent cholera vaccine, methods of their isolation and control]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; (2):1–19. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-12-19.Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Иванов С.А., Комбарова Т.И., Перовская О.Н., Титарева Г.М., Анисимов А.П. Особенности хроматографической очистки и протективности изоформ LcrV Yersinia pestis. Прикладная биохимия и микробиология. 2019; 55(5):471–80. DOI: 10.1134/s0555109919040081.Kopylov P.Kh., Svetoch T.E., Ivanov S.A., Kombarova T.I., Perovskaya O.N., Titareva G.M., Anisimov A.P. [Features of chromatographic purification and protectivity of LcrV Yersinia pestis isoforms]. Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2019; 55(5):471–80. DOI: 10.1134/S0555109919040081.Дятлов И.А., Сомов А.Н., Дунайцев И.А., Копылов П.Х., Иванов С.А., Борзилов А.И., Анисимов А.П., Храмов М .В. Рекомбинантный вакцинный препарат пролонгированного действия для профилактики чумы у млекопитающих и человека и способ его получения. Патент РФ № 2671525 C2, опубл. 01.11.2018. Бюл. № 31.Dyatlov I.A., Somov A.N., Dunaytsev I.A., Kopylov P.Kh., Ivanov S.A., Borzilov A.I., Anisimov A.P., Khramov M.V. [Recombinant vaccine preparation of prolonged action for the prevention of plague in mammals and humans and a method for its production]. RF Patent No. 2671525 C2, published November 01, 2018. Bulletin No. 31.Jones S., Asokanathan C., Kmiec D., Irvine J., Fleck R., Xing D., Moore B., Parton R., Coote J. Protein coated microcrystals formulated with model antigens and modified with calcium phosphate exhibit enhanced phagocytosis and immunogenicity. Vaccine. 2014; 32(33):4234–42. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.09.061.Jones S., Asokanathan C., Kmiec D., Irvine J., Fleck R., Xing D., Moore B., Parton R., Coote J. Protein coated microcrystals formulated with model antigens and modified with calcium phosphate exhibit enhanced phagocytosis and immunogenicity. Vaccine. 2014; 32(33):4234–42. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.09.061.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.Sheridan С. The business of making vaccines. Nat. Biotechnol. 2005; 23(11):1359–66. DOI: 10.1038/nbt1105-1359.Sheridan С. The business of making vaccines. Nat. Biotechnol. 2005; 23(11):1359–66. DOI: 10.1038/nbt1105-1359.ICH – International Conference on Harmonisation Regulations. Q7 – GMP Guide for Active Pharmaceutical Ingredients; Q8(R2) – Pharmaceutical Development; Q9 – Quality Risk Management; Q10 – Pharmaceutical Quality System; Q11 – Development and Manufacture of Drug Substances (Chemical Entities and Biotechnological/Biological Entities). [Электронный ресурс]. URL: https://www.gmppublications.com/product185.html (дата обращения 14.12.2022).ICH – International Conference on Harmonisation Regulations. Q7 – GMP Guide for Active Pharmaceutical Ingredients; Q8(R2) – Pharmaceutical Development; Q9 – Quality Risk Management; Q10 – Pharmaceutical Quality System; Q11 – Development and Manufacture of Drug Substances (Chemical Entities and Biotechnological/Biological Entities). (Cited 14 Dec 2022). [Internet]. Available from: https://www.gmppublications.com/product185.html.Сомов А.Н., Дубровский А.В., Дунайцев И.А., Иванов С.А., Комбарова Т.И., Кочеткова О.Ю., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Тихоненко С.А., Пинчук А.С., Фирстова В.В., Дентовская С.В. Иммуногенные свойства полиэлектролитных микрокапсул, нагруженных антигенами Francisella tularensis или Yersinia pestis. Иммунология. 2019; 40(5):52–61. DOI: 10.24411/0206-4952-2019-15006.Somov A.N., Dubrovsky A.V., Dunaytsev I.A., Ivanov S.A., Kombarova T.I., Kochetkova O.Yu., Kravchenko T.B., Titareva G.M., Tikhonenko S.A., Pinchuk A.S., Firstova V.V., Dentovskaya S.V. [Immunogenic properties of polyelectrolyte microcapsules loaded with Francisella tularensis or Yersinia pestis antigens]. Immunologiya [Immunology]. 2019; 40(5):52–61. DOI: 10.24411/0206-4952-2019-15006.Кочеткова О.Ю., Казакова Л.И., Мошков Д.А., Винокуров М.Г., Шабарчина Л.И. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы методами копреципитации и адсорбции. Биоорганическая химия. 2013; 39(5):565–71. DOI: 10.7868/S0132342313050084.Kochetkova O.Yu., Kazakova L.I., Moshkov D.A., Vinokurov M.G., Shabarchina L.I. [Incorporation of proteins into polyelectrolyte microcapsules by co-precipitation and adsorption methods]. Bioorganicheskaya Khimiya [Bioorganic Chemistry]. 2013; 39(5):565–71. DOI: 10.7868/S0132342313050084.Herrington W.F. Jr., Singh G.P., Wu D., Barone P.W., Hancock W., Ram R.J. Optical detection of degraded therapeutic proteins. Sci. Rep. 2018; 8(1):5089. DOI: 10.1038/s41598-018-23409-z.Herrington W.F. Jr., Singh G.P., Wu D., Barone P.W., Hancock W., Ram R.J. Optical detection of degraded therapeutic proteins. Sci. Rep. 2018; 8(1):5089. DOI: 10.1038/s41598-018-23409-z.Yang Y., Su Z., Ma G., Zhang S. Characterization and stabilization in process development and product formulation for super large proteinaceous particles. Eng. Life Sci. 2020; 20(11):451–65. DOI: 10.1002/elsc.202000033.Yang Y., Su Z., Ma G., Zhang S. Characterization and stabilization in process development and product formulation for super large proteinaceous particles. Eng. Life Sci. 2020; 20(11):451–65. DOI: 10.1002/elsc.202000033.Буданова А.А., Щуковская Т.Н. Исследования in silico на этапах конструирования современных средств иммунопрофилактики чумы (на примере субъединичных вакцин). Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:6–13. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-6-13.Budanova A.A., Shchukovskaya T.N. [In silico research at the stages of designing modern means for prevention of plague (by the example of subunit vaccines)]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; (3):6–13. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-6-13.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.