microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-1-105-110microbe-1795Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПолучение и характеристика гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам коронавируса SARS-CоV-2Obtaining and Characterization of Hybridomas Producing Monoclonal Antibodies against Coronavirus SARS-CоV-2https://orcid.org/0000-0002-5429-6295КуклинаГ. В.KuklinaG. V.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2881-4730ИпатовС. С.IpatovS. S.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5164-3645ГоршковА. С.GorshkovA. S.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8277-3573ПеченкинД. В.PechenkinD. V.

Печенкин Денис Валериевич

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

Denis V. Pechenkin

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3133-1921ЕремкинА. В.EremkinA. V.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruКузнецовскийА. В.KuznetsovskyA. V.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruТумановА. С.TumanovA. S.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruДармовИ. В.DarmovI. V.

Российская Федерация, 610017, Киров, Октябрьский пр-т, 119

119, Oktyabrsky Avenue, Kirov, 610017, Russian Federation

23527@mil.ruФилиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияAffiliated Branch of the “48th Central Research Institute” of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation20230105202301105110Copyright © Куклина Г.В., Ипатов С.С., Горшков А.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кузнецовский А.В., Туманов А.С., Дармов И.В., 20232023Куклина Г.В., Ипатов С.С., Горшков А.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кузнецовский А.В., Туманов А.С., Дармов И.В.Kuklina G.V., Ipatov S.S., Gorshkov A.S., Pechenkin D.V., Eremkin A.V., Kuznetsovsky A.V., Tumanov A.S., Darmov I.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1795

Цель работы – получить и охарактеризовать гибридомы-продуценты моноклональных антител к антигенам коронавируса SARS‑CoV‑2, перспективных для конструирования диагностических иммунохимических тестов. Материалы и методы. Для иммунизации мышей линии BALB/c использовали рекомбинантные антигены NP и RBD SARS-CоV-2. Антигенные препараты сорбировали на геле алюминия гидроксида и вводили подкожно мышам линии BALB/c с интервалом 7 дней. Слияние иммунных спленоцитов с клетками миеломной опухоли SP2/0-Ag14 проводили с помощью ПЭГ -1450. Отбор гибридом, секретирующих анти-NP- и анти-RBD-антитела, проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) в 96-луночных планшетах с сорбированными препаратами NP и RBD. Для клонирования гибридом использовали метод предельных разведений. Изучение секреторных свойств полученных клонов проводили при культивировании in vitro в 24-луночных культуральных планшетах. Иммуноасцитические жидкости получали при культивировании гибридных клеток в брюшной полости мышей линии BALB/c. Моноклональные антитела очищали методом аффинной хроматографии на сорбенте протеин А-сефарозе, конъюгировали с пероксидазой хрена и проверяли возможность использования в сэндвич-варианте ИФА для детекции инактивированного коронавируса SARS-CоV-2 штамма «Изолят В». Результаты и обсуждение. В результате гибридизаций и отбора клонов получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к NP и RBD коронавируса SARS-CоV-2. При культивировании in vitro и in vivo клоны характеризовались стабильностью пролиферативной и антителопродуцирующей активности. Использование моноклонального антитела 415D12 в качестве захватывающего и конъюгированного с пероксидазой хрена 411D12 в качестве детекторного моноклонального антитела в ИФА позволяет выявить коронавирус SARS-CоV-2 в минимальной концентрации 1·103 БОЕ /мл.

The aim of the work was to obtain and characterize hybridomas producing monoclonal antibodies to antigens of coronavirus SARS‑CoV‑2, promising for the construction of diagnostic immunochemical tests. Materials and methods. Recombinant nucleocapsid and receptor binding fragment of spike protein of SARS‑CoV‑2 were used for immunization of BALB/c mice. Antigens were absorbed on aluminium hydroxide gel and injected subcutaneously to BALB/c mice at a 7-day-interval. Immune splenocytes and myeloma cells SP2/0-Ag14 were fused by polyethylene glycol 1450. Cell cultures producing specific antibodies against nucleocapsid and receptor binding fragment were selected applying indirect ELISA in 96-well plates sensitized by desired antigens. Clones of hybridomas were obtained using the method of limiting dilutions. Production properties were studied through in vitro cultivation in 24-well culture plates. Immune-ascitic fluids were collected during the cultivation of hybrid cells in peritoneal cavities of BALB/c mice. Monoclonal antibodies were purified by affinity chromatography on protein A sepharose sorbent, conjugated with horseradish peroxidase, and tested for the possibility to be used in sandwich ELISA for detection of inactivated SARS‑CoV‑2 coronavirus strain “Isolate B”. Results and discussion. As a result of hybridization and selection of clones, hybridomas producing monoclonal antibodies to nucleocapsid and receptor binding fragment of SARS‑CoV‑2 have been obtained. During the in vitro and in vivo cultivation the clones maintained the consistent proliferative and antibody producing activity. The application of monoclonal antibody 415D12 as a capture one and 411D12 antibody conjugated with horseradish peroxidase as a detector antibody in ELISA allows for identifying SARS‑CoV‑2 coronavirus at a minimum concentration of 1·103 PFU per ml.

коронавирус SARS-CоV-2гибридомымоноклональные антителаиммуноферментный анализSARS-CоV-2 coronavirushybridomasmonoclonal antibodiesenzyme linked immunosorbent assayReferencesSARS‑CoV‑2-related data provided by the Protein Domains resource [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/SARS‑CoV‑2.html (дата обращения 15.08.2022).SARS‑CoV‑2-related data provided by the Protein Domains resource. (Cited 15 Aug 2022). [Internet]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/SARS‑CoV‑2.html.Guo L., Ren L., Yang S., Xiao M., Chang D., Yang F., Dela Cruz C.S., Wang Y., Wu C., Xiao Y., Zhang L., Han L., Dang S., Xu Y., Yang Q.W., Xu S.Y., Zhu H.D., Xu Y.C., Jin Q., Sharma L., Wang L., Wang J. Profiling early humoral response to diagnose novel coronavirus disease (COVID-19). Clin. Infect. Dis. 2020; 71(15):778–5. DOI: 10.1093/cid/ciaa310.Guo L., Ren L., Yang S., Xiao M., Chang D., Yang F., Dela Cruz C.S., Wang Y., Wu C., Xiao Y., Zhang L., Han L., Dang S., Xu Y., Yang Q.W., Xu S.Y., Zhu H.D., Xu Y.C., Jin Q., Sharma L., Wang L., Wang J. Profiling early humoral response to diagnose novel coronavirus disease (COVID-19). Clin. Infect. Dis. 2020; 71(15):778–5. DOI: 10.1093/cid/ciaa310.Shanmugaraj B., Siriwattananon K., Wangkanont K., Phoolcharoen W. Perspectives on monoclonal antibody therapy as potential therapeutic intervention for Coronavirus disease-19 (COVID-19). Asian Рас. J. Allergy Immunol. 2020; 38(1):10–8. DOI: 10.12932/AP-200220-0773.Shanmugaraj B., Siriwattananon K., Wangkanont K., Phoolcharoen W. Perspectives on monoclonal antibody therapy as potential therapeutic intervention for Coronavirus disease-19 (COVID-19). Asian Рас. J. Allergy Immunol. 2020; 38(1):10–8. DOI: 10.12932/AP-200220-0773.Wang C., Li W., Drabek D., Okba N.M.A., van Haperen R., Osterhaus A.D.M.E., van Kuppeveld F.J.M., Haagmans B.L., Grosveld F., Bosch B.J. A human monoclonal antibody blocking SARS‑CoV‑2 infection. Nat. Commun. 2020; 11(1):2251. DOI: 10.1038/s41467-020-16256-y.Wang C., Li W., Drabek D., Okba N.M.A., van Haperen R., Osterhaus A.D.M.E., van Kuppeveld F.J.M., Haagmans B.L., Grosveld F., Bosch B.J. A human monoclonal antibody blocking SARS‑CoV‑2 infection. Nat. Commun. 2020; 11(1):2251. DOI: 10.1038/s41467-020-16256-y.Шевяков А.Г. Получение мышиных моноклональных антител к нуклеокапсиду нового коронавируса SARS‑CoV‑2. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23(2):164.Sheviakov A.G. [Development of mouse monoclonal antibodies specific for nucleocapsid of novel coronavirus SARS‑CoV‑2]. Problemy Meditsinskoy Mikologii [Problems in Medical Mycology]. 2021; 23(2):164.Xie С., Ding Н., Ding J., Xue Y., Lu S., Lv H. Preparation of highly specific monoclonal antibodies against SARS‑CoV‑2 nucleocapsid protein and the preliminary development of antigen detection test strips. J. Med. Virol. 2022; 94(4):1633–40. DOI: 10.1002/jmv.27520.Xie С., Ding Н., Ding J., Xue Y., Lu S., Lv H. Preparation of highly specific monoclonal antibodies against SARS‑CoV‑2 nucleocapsid protein and the preliminary development of antigen detection test strips. J. Med. Virol. 2022; 94(4):1633–40. DOI: 10.1002/jmv.27520.Чуркин И.А., Ручко С.В., Суровяткина И.В., Лебедев В.Н., Панкова Е.И., Сыромятникова С.И., Степанов Н.Н., Харченко В.А., Максимов В.А. Штамм гибридных клеток T2/S-6E11 животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к коронавирусу – возбудителю тяжелого острого респираторного синдрома. Патент РФ № 2291195, опубл. 10.01.2007.Churkin I.A., Ruchko S.V., Surovyatkina I.V., Lebedev V.N., Pankova E.I., Syromyatnikova S.I., Stepanov N.N., Kharchenko V.A., Maksimov V.A. [Strains of hybrid cells T2/S-6E11 of Mus musculus L., producing monoclonal antibodies to coronavirus – causative agent of severe acute respiratory syndrome]. RF Patent No. 2291195, publ. January10, 2007.Шахпаронов М.И., Павлюков М.С., Антипова Н.В. Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS‑CoV‑2. Патент РФ № 2744274, опубл. 04.03.2021.Shakhparonov M.I., Pavlyukov M.S., Antipova N.V. [Monoclonal antibody to RBD-fragment in S-protein of SARS‑CoV‑2]. RF Patent No. 2744274, publ. March 04, 2021.Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Лебедин Ю.С. Фаворская И.А., Должикова И.В., Деркаев А.А., Рябова Е.И., Прокофьев В.В., Алексеева И.А., Воронина Д.В., Зорков И.Д., Ковыршина А.В., Илюхина А.А., Ботиков А.Г., Карпов А.П., Лубенец Н.Л., Зубкова О.В., Семихин А.С., Народицкий Б.С., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л. Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS‑CoV‑2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS‑CoV‑2. Патент РФ № 2765731, опубл. 02.02.2022.Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Lebedin Yu.S., Favorskaya I.A., Dolzhikova I.V., Derkaev A.A., Ryabova E.I., Prokof’ev V.V., Alekseeva I.A., Voronina D.V., Zorkov I.D., Kovyrshina A.V., Ilyukhina A.A., Botikov A.G., Karpov A.P., Lubenets N.L., Zubkova O.V., Semikhin A.S., Naroditsky B.S., Logunov D.Yu., Gintsburg A.L. [Humanized monoclonal antibody specifically binding to RBD of S-protein of SARS‑CoV‑2, means and method for therapy and emergency prevention of diseases caused by SARS‑CoV‑2 virus]. RF Patent No. 2765731, publ. February 02, 2022.Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.de StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1‑2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.de StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1‑2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.Lu R.-M., Ko S.-H., Chen W.-Y., Chang Y.-L., Lin H.-T., Wu H.-C. Monoclonal antibodies against nucleocapsid protein of SARS‑CoV‑2 variant for detection of COVID-19. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22(22):12412. DOI: 10.3390/ijms222212412.Lu R.-M., Ko S.-H., Chen W.-Y., Chang Y.-L., Lin H.-T., Wu H.-C. Monoclonal antibodies against nucleocapsid protein of SARS‑CoV‑2 variant for detection of COVID-19. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22(22):12412. DOI: 10.3390/ijms222212412.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.