microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-1-126-131microbe-1798Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка комплексной системы молекулярно-генетической идентификации штаммов Yersinia pestisDevelopment of an Integrated System for Molecular-Genetic Identification of Yersinia pestis Strainshttps://orcid.org/0000-0002-4115-9486НикифоровК. А.NikiforovK. A.

Никифоров Константин Алексеевич

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Konstantin A. Nikiforov

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2955-3034ОглодинЕ. Г.OglodinE. G.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7713-7959МакашоваМ. А.MakashovaM. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3766-7979БалыковаА. Н.BalykovaA. N.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5903-7700УткинД. В.UtkinD. V.

Российская Федерация, 410012, Саратов, ул. Астраханская, 83

83, Astrakhanskaya St., Saratov, 410012, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-2438-8364КуклеваЛ. М.KuklevaL. M.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5403-989XЕрошенкоГ. А.EroshenkoG. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3788-3452КутыревВ. В.KutyrevV. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian FederationФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»РоссияSaratov National Research State University named after N.G. ChernyshevskyRussian Federation20230205202301126131Copyright © Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Макашова М.А., Балыкова А.Н., Уткин Д.В., Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., 20232023Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Макашова М.А., Балыкова А.Н., Уткин Д.В., Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В.Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Makashova M.A., Balykova A.N., Utkin D.V., Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1798

В статье представлена разработанная комплексная система молекулярно-генетической идентификации штаммов Yersinia pestis в соответствии с их принадлежностью к подвидам, биоварам и филогеографическим популяциям, с помощью методов ПЦР в режиме реального времени (ПЦР -РВ ), аллель-специфической ПЦР -РВ и мультиплексных ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на твердой подложке. С использованием этой системы возможно установление принадлежности штаммов Y. pestis к следующим филогенетическим ветвям: 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT античного биовара основного подвида; 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4 средневекового биовара основного подвида; 1.IN1, 1.IN2, 1.IN3 биовара intermedium основного подвида; 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3 восточного биовара основного подвида; 0.PE3 (ангольский подвид), 0.PE7 (тибетский подвид) и 0.PE10 (цинхайский подвид). Первый этап исследований в рамках разработанной системы – индикация возбудителя чумы с использованием зарегистрированных диагностических препаратов. Второй этап – установление принадлежности к отдельным подвидам методом ПЦР -РВ или методом системы мультиплексных ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на твердой подложке, позволяющей также определять принадлежность штаммов к биоварам основного подвида и основным филогенетическим линиям античного биовара. Третий этап – определение принадлежности штаммов к филогенетическим ветвям методом АС -ПЦР -РВ . Разработанная комплексная система молекулярно-генетической идентификации штаммов Y. pestis может быть применена на региональном и федеральном уровнях системы лабораторной диагностики инфекционных болезней Российской Федерации. Ее использование значительно облегчит и повысит оперативность проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis в рамках эпидемиологического расследования вспышек или заносов штаммов возбудителя чумы на территорию Российской Федерации или при паспортизации штаммов в коллекционной деятельности.

The paper describes a developed comprehensive system for molecular-genetic identification of Yersinia pestis strains according to their appurtenance to certain subspecies, biovars, phylo-geographic populations, using realtime PCR (RT-PCR), allele-specific RT-PCR, and multiplex PCR with hybridization fluorescent registration of results on a solid substrate. Application of this system makes it possible to establish the appurtenance of Y. pestis strains to the following phylogenetic branches: 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT of antique biovar of the main subspecies; 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4 of medieval biovar of the main subspecies; 1.IN1, 1.IN2, 1.IN3 of intermedium biovar of the main subspecies; 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3 of oriental biovar of the main subspecies; 0.PE3 (angolica subspecies), 0.PE7 (tibetica subspecies) and 0.PE10 (qinghaica subspecies). The first stage of the studies within the frames of the developed system is indication of plague agent using registered diagnostic drugs. The second stage is the determination of belonging to individual subspecies through RT-PCR or by the method of multiplex PCR system with hybridization-fluorescent registration of results on a solid substrate, which also allows for establishing to which biovars of the main subspecies and the main phylogenetic lines of the ancient biovar the strains belong. The third stage is the identification of strain appurtenance to phylogenetic branches by the AS-RT-PCR method. The designed complex system for molecular-genetic identification of Y. pestis strains can be applied at the regional and federal levels of the laboratory network of the Russian Federation for diagnostics of infectious diseases. Its use will considerably facilitate and increase the efficiency of intraspecific differentiation of Y. pestis strains within the framework of the epidemiological investigation of outbreaks or importation of strains of plague pathogen into the territory of the Russian Federation or during the certification of strains in collection activities.

возбудитель чумымолекулярно-генетические методыидентификация штаммовplague agentmolecular-genetic methodsidentification of strainsReferencesKutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov J.M., Kukleva L.M., Nikiforov K.A., Al’khova Z.V., Oglodin E.G., Guseva N.P. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9:1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov J.M., Kukleva L.M., Nikiforov K.A., Al’khova Z.V., Oglodin E.G., Guseva N.P. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9:1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96(24):14043–8. DOI: 10.1073/pnas.96.24.14043.Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96(24):14043–8. DOI: 10.1073/pnas.96.24.14043.Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M., Feldkamp M., Kusecek B., Vogler A.J., Li Y., Cui Y., Thomson N.R., Jombart T., Leblois R., Lichtner P., Rahalison L., Petersen J.M., Balloux F., Keim P., Wirth T., Ravel J., Yang R., Carniel E., Achtman M. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42(12):1140–3. DOI: 10.1038/ng.705.Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M., Feldkamp M., Kusecek B., Vogler A.J., Li Y., Cui Y., Thomson N.R., Jombart T., Leblois R., Lichtner P., Rahalison L., Petersen J.M., Balloux F., Keim P., Wirth T., Ravel J., Yang R., Carniel E., Achtman M. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42(12):1140–3. DOI: 10.1038/ng.705.Cui Y., Yu C., Yan Y., Li D., Li Y., Jombart T., Weinert L.A., Wang Z., Guo Z., Xu L., Zhang Y., Zheng H., Qin N., Xiao X., Wu M., Wang X., Zhou D., Qi Z., Du Z., Wu H., Yang X., Cao H., Wang H., Wang J., Yao S., Rakin A., Li Y., Falush D., Balloux F., Achtman M., Song Y., Wang J., Yang R. Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110(2):577–82. DOI: 10.1073/pnas.1205750110.Cui Y., Yu C., Yan Y., Li D., Li Y., Jombart T., Weinert L.A., Wang Z., Guo Z., Xu L., Zhang Y., Zheng H., Qin N., Xiao X., Wu M., Wang X., Zhou D., Qi Z., Du Z., Wu H., Yang X., Cao H., Wang H., Wang J., Yao S., Rakin A., Li Y., Falush D., Balloux F., Achtman M., Song Y., Wang J., Yang R. Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110(2):577–82. DOI: 10.1073/pnas.1205750110.Zhang Y., Luo T., Yang C., Yue X., Guo R., Wang X., Buren M., Song Y., Yang R., Cao H., Cui Y., Dai X. Phenotypic and molecular genetic characteristics of Yersinia pestis at an emerging natural plague focus, Junggar Basin, China. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2018; 98(1):231–7. DOI: 10.4269/ajtmh.17-0195.Zhang Y., Luo T., Yang C., Yue X., Guo R., Wang X., Buren M., Song Y., Yang R., Cao H., Cui Y., Dai X. Phenotypic and molecular genetic characteristics of Yersinia pestis at an emerging natural plague focus, Junggar Basin, China. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2018; 98(1):231–7. DOI: 10.4269/ajtmh.17-0195.Shi L., Qin J., Zheng H., Guo Y., Zhang H., Zhong Y., Yang C., Dong S., Yang F., Wu Y., Zhao G., Song Y., Yang R., Wang P., Cui Y. New genotype of Yersinia pestis found in live rodents in Yunnan Province, China. Front. Microbiol. 2021; 12:628335. DOI: 10.3389/fmicb.2021.628335.Shi L., Qin J., Zheng H., Guo Y., Zhang H., Zhong Y., Yang C., Dong S., Yang F., Wu Y., Zhao G., Song Y., Yang R., Wang P., Cui Y. New genotype of Yersinia pestis found in live rodents in Yunnan Province, China. Front. Microbiol. 2021; 12:628335. DOI: 10.3389/fmicb.2021.628335.Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P., Worsham P.L., Ott L.L., Slezak T.R., Sokhansanj B.A., Regala W.M., Brubaker R.R., Garcia E. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD). J. Bacteriol. 2002; 184(4):1019–27. DOI: 10.1128/jb.184.4.1019-1027.2002.Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P., Worsham P.L., Ott L.L., Slezak T.R., Sokhansanj B.A., Regala W.M., Brubaker R.R., Garcia E. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD). J. Bacteriol. 2002; 184(4):1019–27. DOI: 10.1128/jb.184.4.1019-1027.2002.Soleimani V.D., Baum B.R., Johnson D.A. Efficient validation of single nucleotide polymorphisms in plants by allele-specific PCR, with an example from barley. Plant Mol. Biol. Rep. 2003; 21:281–8. DOI: 10.1007/BF02772803.Soleimani V.D., Baum B.R., Johnson D.A. Efficient validation of single nucleotide polymorphisms in plants by allele-specific PCR, with an example from barley. Plant Mol. Biol. Rep. 2003; 21:281–8. DOI: 10.1007/BF02772803.Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Германчук В.Г., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Подвидовая дифференциация штаммов Yersinia pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. 2017; 2:22–7. DOI: 10.36233/0372-9311-2017-2-22-27.Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Germanchuk V.G., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. [Subspecies differentiation of Yersinia pestis strains by PCR with hybridizationfluorescence detection]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii, Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology, Immunobiology]. 2017; (2):22–7. DOI: 10.36233/0372-9311-2017-2-22-27.Никифоров К.А., Уткин Д.В., Макашова М.А., Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Конструирование системы мультиплексных ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на твердой подложке для индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы. Биотехнология. 2020; 36(3):46–56. DOI: 10.21519/0234-2758-2020-36-3-46-56.Nikiforov K.A., Utkin D.V., Makashova M.A., Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. [Designing a system of multiplex PCR with hybridization-fluorescent registration of results, on a solid substrate, for indication and identification of Y. pestis strains]. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2020; 36(3):46–56. DOI: 10.21519/0234-2758-2020-36-3-46-56.Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Куклева Л.М., Макашова М.А., Балыкова А.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Конструирование системы аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени для определения филогенетической принадлежности штаммов Yersinia pestis. Биотехнология. 2022; 38(3):82–91. DOI: 10.56304/S0234275822030073.Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Kukleva L.M., Makashova M.A., Balykova A.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. [Construction of a real-time allele-specific PCR system for determining the phylogenetic affiliation of Yersinia pestis strains]. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2022; 38(3):82–91. DOI: 10.56304/S0234275822030073.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.