microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-1-132-141microbe-1799Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВнутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времениIntraspecific Differentiation of Francisella tularensis Strains Using Multilocus Real-Time Polymerase Chain Reactionhttps://orcid.org/0000-0003-0954-5683ОсинаН. А.OsinaN. A.

Осина Наталия Александровна

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Natalia A. Osina

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2766-2624СитмбетовД. А.SitmbetovD. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2405-2684БулгаковаЕ. Г.BulgakovaE. G.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5487-2240ЧекмареваС. С.ChekmarevaS. S.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9140-3910СазановаЕ. В.SazanovaE. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1026-2680СеничкинаА. М.SenichkinaA. M.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1332-9580ЛяшоваО. Ю.LyashovaO. Yu.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5308-0022ОсинА. В.OsinA. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1143-4069ЩербаковаС. А.ShcherbakovaS. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20230205202301132141Copyright © Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Булгакова Е.Г., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Осин А.В., Щербакова С.А., 20232023Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Булгакова Е.Г., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Осин А.В., Щербакова С.А.Osina N.A., Sitmbetov D.A., Bulgakova E.G., Chekmareva S.S., Sazanova E.V., Senichkina A.M., Lyashova O.Y., Osin A.V., Shcherbakova S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1799

Цель – разработка способа внутривидовой дифференциации туляремийного микроба: подвиды tularensis (субпопуляции AI и AII), holarctica (биовары japonica, EryS/R), mediasiatica и novicida – с помощью мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Материалы и методы. В работе использовали 48 штаммов Francisella tularensis различных подвидов, биоваров и субпопуляций. Внутривидовую принадлежность штаммов устанавливали на основании анализа вариабельности области дифференциации RD-1 методом ПЦР , гена sdhA – методом фрагментного секвенирования по Сэнгеру, диско-диффузионным методом с использованием дисков с эритромицином. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRunner 6.5.52. Оценку гомологии последовательностей – по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. Результаты и обсуждение. Получены новые данные по структуре и встречаемости областей дифференциации RD-8, RD-12, RD-28, гена FTT1122с и гомологичных ему последовательностей у штаммов туляремийного микроба различной подвидовой принадлежности. Выявлена новая RDhm размером 346 п.н., характерная для штаммов subsp. mediasiatica, holarctica, которая делетирована у subsp. tularensis и отсутствует у subsp. novicida. На основе выявления локусов FTT1670, FTT1122с, FTT1067, FTW_2084 разработана мультилокусная ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени «F. tularensis 4c», обеспечивающая определение всех подвидов туляремийного микроба, отдельно биовара japonica голарктического подвида и субпопуляций АI, AII подвида tularensis. Подтверждена ее специфичность при исследовании штаммов туляремийного микроба из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб». Полученные результаты расширяют представление о внутривидовой генетической неоднородности туляремийного микроба и возможности идентификации возбудителя туляремии с помощью молекулярно-генетических методов. Они также важны для понимания процессов приспособления возбудителя к циркуляции в макроорганизме и объектах окружающей среды, направлений эволюции и образования новых видов франциселл.

The aim of the study was to develop a method for intraspecific differentiation of the tularemia microbe: subspecies tularensis (subpopulations AI and AII), holarctica (biovars japonica, EryS/R), mediasiatica, and novicida using multilocus real-time PCR. Materials and methods. We used 48 strains of F. tularensis of various subspecies, biovars, and subpopulations. Intraspecific appurtenance of the strains was carried out on the basis of the analysis of the RD-1 region variability applying PCR, the sdhA gene by Sanger fragment sequencing and by the disk diffusion method using disks with erythromycin. The selection of primers and probes was performed using the software available at www.genscript.com and GeneRunner 6.5.52. Sequence homology was assessed using the BLAST algorithm and the GenBank NCBI database. Results and discussion. New data on the structure and occurrence of the differentiation regions RD-8, RD-12, RD-28 of FTT1122c gene and its homologous sequences in strains of tularemia microbe of various subspecies have been obtained. Novel RDhm 346 bp in size, characteristic of strains of the subsp. mediasiatica, holarctica, which is deleted in subsp. tularensis and absent in subsp. novicida has been detected. Based on the detection of the FTT1670, FTT1122с, FTT1067, FTW_2084 loci, a multilocus real-time PCR has been developed – “F. tularensis 4c”, providing for identification of all subspecies of the tularemia microbe, separately for the biovar japonica of the Holarctic subspecies and subpopulations AI, AII of the subspecies tularensis. The PCR specificity was confirmed in the study of strains of tularemia microbe from the fund of the “State Collection of Pathogenic Bacteria” at the premises of the Russian Reserarch Anti-Plague Institute “Microbe”. The results obtained expand the concept of intraspecific genetic heterogeneity of tularemia microbe and possibilities of identifying the causative agent of tularemia using molecular-genetic methods. They are important for understanding the processes of adaptation of the pathogen to circulation in the host organism and environmental objects, the course of evolution and formation of new species of Francisella.

мультилокусная ПЦРвнутривидовая дифференциацияFrancisella tularensisбиоварыподвидыобласти дифференциации RDструктурная организацияmultilocus PCRintraspecific differentiationFrancisella tularensisbiovarssubspeciesRD differentiation regionsstructural organizationReferencesList of Procariotic names with Standing in Nomenclature (LPSN). [Электронный ресурс]. URL: http://www.bacterio.net/francisella.html (дата обращения 15.01.2023).List of Procariotic names with Standing in Nomenclature (LPSN). (Cited 15 Jan 2023). [Internet]. Available from: http://www.bacterio.net/francisella.htmlMolins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis AI and AII strains. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.Molins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis AI and AII strains. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.Gunnell M.K., Lovelace C.D., Satterfield B.A., Moore E.A., O’Neill K.L., Robison R.A. A multiplex real-time PCR assay for the detection and differentiation of Francisella tularensis subspecies. J. Med. Microbiol. 2012; 61(Pt. 1):1525–31. DOI: 10.1099/jmm.0.046631-0.Gunnell M.K., Lovelace C.D., Satterfield B.A., Moore E.A., O’Neill K.L., Robison R.A. A multiplex real-time PCR assay for the detection and differentiation of Francisella tularensis subspecies. J. Med. Microbiol. 2012; 61(Pt. 1):1525–31. DOI: 10.1099/jmm.0.046631-0.Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.Woubit A., Yehualaeshet T., Habtemariam T., Samuel T. Novel genomic tools for specific and real-time detection of biothreat and frequently encountered food-borne pathogens. J. Food Prot. 2012; 75(4):660–70. DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-11-480.Woubit A., Yehualaeshet T., Habtemariam T., Samuel T. Novel genomic tools for specific and real-time detection of biothreat and frequently encountered food-borne pathogens. J. Food Prot. 2012; 75(4):660–70. DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-11-480.Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924–31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924–31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.Осина Н.А., Мошкова М.С., Уткин Д.В., Ляшова О.Ю., Куличенко А.Н. Идентификация подвидов туляремийного микроба методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Проблемы особо опасных инфекций. 2007; 1:92–3.Osina N.A., Moshkova M.S., Utkin D.V., Lyashova O.Yu., Kulichenko A.N. [Identification of subspecies of the tularemia microbe multiplex polymerase chain reaction]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2007; (1):92–3.Вахрамеева Г.М., Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР -дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.Vakhrameeva G.M., Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Mironova R.I., Dyatlov I.A. [PCR differentiation of Francisella tularensis subspecies using one primer]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2011; 1(107):46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020. 58(4):e01495-19. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020. 58(4):e01495-19. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.Сорокин В.М., Водопьянов А.С., Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Дифференциация подвидов Francisella tularensis методом INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.Sorokin V.M., Vodop’yanov A.S., Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V. [Differentiation of Francisella tularensis subspecies using INDEL typing]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunology]. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.Champion M.D., Zeng Q., Nix E.B., Nano F.E., Keim P., Kodira C.D., Borowsky M., Young S., Koehrsen M., Engels R., Pearson M., Howarth C., Larson L., White J., Alvarado L., Forsman M., Bearden S.W., Sjöstedt A., Titball R., Michell S.L., Birren B., Galagan J. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000459. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000459.Champion M.D., Zeng Q., Nix E.B., Nano F.E., Keim P., Kodira C.D., Borowsky M., Young S., Koehrsen M., Engels R., Pearson M., Howarth C., Larson L., White J., Alvarado L., Forsman M., Bearden S.W., Sjöstedt A., Titball R., Michell S.L., Birren B., Galagan J. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000459. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000459.Rohmer L., Fong C., Abmayr S., Wasnick M., Larson Freeman T.J, Radey M., Guina T., Svensson K., Hayden H.S., Jacobs M., Gallagher L.A., Manoil C., Ernst R.K., Drees B., Buckley D., Haugen E., Bovee D., Zhou Y., Chang J., Levy R., Lim R., Gillett W., Guenthener D., Kang A., Shaffer S.A., Taylor G., Chen J., Gallis B., D’Argenio D.A., Forsman M., Olson M.V., Goodlett D.R., Kaul R., Miller S.I., Brittnacher M.J. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 2007; 8(6):R102. DOI: 10.1186/gb-2007-8-6-r102.Rohmer L., Fong C., Abmayr S., Wasnick M., Larson Freeman T.J, Radey M., Guina T., Svensson K., Hayden H.S., Jacobs M., Gallagher L.A., Manoil C., Ernst R.K., Drees B., Buckley D., Haugen E., Bovee D., Zhou Y., Chang J., Levy R., Lim R., Gillett W., Guenthener D., Kang A., Shaffer S.A., Taylor G., Chen J., Gallis B., D’Argenio D.A., Forsman M., Olson M.V., Goodlett D.R., Kaul R., Miller S.I., Brittnacher M.J. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 2007; 8(6):R102. DOI: 10.1186/gb-2007-8-6-r102.LeButt H. The Construction and Use of a Francisella tularensis DNA Microarray. PhD thesis The Open University. 2008. DOI: 10.21954/ou.ro.0000fd6f.LeButt H. The Construction and Use of a Francisella tularensis DNA Microarray. PhD thesis The Open University. 2008. DOI: 10.21954/ou.ro.0000fd6f.Sarva S.T., Waldo R.H., Belland R.J., Klose K.E. Comparative transcriptional analyses of Francisella tularensis and Francisella novicida. PLoS One. 2016; 11(8):e0158631. DOI: 10.1371/journal. pone.0158631.Sarva S.T., Waldo R.H., Belland R.J., Klose K.E. Comparative transcriptional analyses of Francisella tularensis and Francisella novicida. PLoS One. 2016; 11(8):e0158631. DOI: 10.1371/journal. pone.0158631.Samrakandi M.M., Zhang C., Zhang M., Nietfeldt J., Kim J., Iwen P.C., Olson M.E., Fey P.D., Duhamel G.E., Hinrichs S.H., Cirillo J.D., Benson A.K. Genome diversity among regional populations of Francisella tularensis subspecies tularensis and Francisella tularensis subspecies holarctica isolated from the US. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 237(1):9–17. DOI: 10.1016/j.femsle.2004.06.008.Samrakandi M.M., Zhang C., Zhang M., Nietfeldt J., Kim J., Iwen P.C., Olson M.E., Fey P.D., Duhamel G.E., Hinrichs S.H., Cirillo J.D., Benson A.K. Genome diversity among regional populations of Francisella tularensis subspecies tularensis and Francisella tularensis subspecies holarctica isolated from the US. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 237(1):9–17. DOI: 10.1016/j.femsle.2004.06.008.Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Byström M., Fox J., Chu M., Forsman M., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186(17):5808–18. DOI: 10.1128/JB.186.17.5808–5818.2004.Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Byström M., Fox J., Chu M., Forsman M., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186(17):5808–18. DOI: 10.1128/JB.186.17.5808–5818.2004.Chandler J.C., Molins C.R., Petersen J.M., Belisle J.T. Differential chitinase activity and production within Francisella species, subspecies, and subpopulations. J. Bacteriol. 2011; 193(13):3265–75. DOI: 10.1128/JB.00093-11.Chandler J.C., Molins C.R., Petersen J.M., Belisle J.T. Differential chitinase activity and production within Francisella species, subspecies, and subpopulations. J. Bacteriol. 2011; 193(13):3265–75. DOI: 10.1128/JB.00093-11.Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для генно-диагностических исследований. Патент РФ № 2443772, опубл. 27.02.2012. Бюл. № 6.Osina N.A., Utkin D.V., Senichkina A.M., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V. [A panel of bacterial strains of the species Francisella tularensis for obtaining a set of control DNA preparations, a set of DNA preparations for genetic diagnostic studies]. RF patent No. 2443772, publ. 02/27/2012. Bull. No. 6.Barns S.M., Grow C.C., Okinaka R.T., Keim P., Kuske C.R. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71(9):5494–500. DOI: 10.1128/AEM.71.9.5494-5500.2005.Barns S.M., Grow C.C., Okinaka R.T., Keim P., Kuske C.R. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71(9):5494–500. DOI: 10.1128/AEM.71.9.5494-5500.2005.Berrada Z.L., Telford S.R. Diversity of Francisella species in environmental samples from Martha’s Vineyard, Massachusetts. Microb. Ecol. 2010; 59(2):277–83. DOI: 10.1007/s00248-009-9568-y.Berrada Z.L., Telford S.R. Diversity of Francisella species in environmental samples from Martha’s Vineyard, Massachusetts. Microb. Ecol. 2010; 59(2):277–83. DOI: 10.1007/s00248-009-9568-y.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.