microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-1-142-147microbe-1800Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESТипирование некультивируемых изолятов Coxiella burnetii и Coxiella-подобных микроорганизмов, ассоциированных с клещами, с применением анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНКTyping of Uncultured Isolates of Coxiella burnetii and Coxiella-Like Microorganisms Associated with Ticks Using 16S rRNA Gene Nucleotide Sequence Analysishttps://orcid.org/0000-0001-5211-5086ПанфероваЮ. А.PanferovaYu. A.

Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

14, Mira St., Saint Petersburg, 197101, Russian Federation

pasteur@pasteurorg.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6433-3486ТокаревичН. К.TokarevichN. K.

Токаревич Николай Константинович

Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

Nikolay K. Tokarevich

14, Mira St., Saint Petersburg, 197101, Russian Federation

pasteur@pasteurorg.ruБлиноваО. В.BlinovaO. V.

Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

14, Mira St., Saint Petersburg, 197101, Russian Federation

pasteur@pasteurorg.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3113-6018НафеевА. А.NafeevA. A.

Российская Федерация, 432049, Ульяновск, ул. Пушкарева, 5

5, Pushkareva St., Ulyanovsk, 432049, Russian Federation

СибаеваЭ. И.SibaevaE. I.

Российская Федерация, 432049, Ульяновск, ул. Пушкарева, 5

5, Pushkareva St., Ulyanovsk, 432049, Russian Federation

ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»РоссияPasteur St. Petersburg Research Institute of Epidemiology and MicrobiologyRussian FederationФГБУ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области»РоссияCenter of Hygiene and Epidemiology in the Ulyanovsk RegionRussian Federation20230305202301142147Copyright © Панферова Ю.А., Токаревич Н.К., Блинова О.В., Нафеев А.А., Сибаева Э.И., 20232023Панферова Ю.А., Токаревич Н.К., Блинова О.В., Нафеев А.А., Сибаева Э.И.Panferova Y.A., Tokarevich N.K., Blinova O.V., Nafeev A.A., Sibaeva E.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1800

Возбудитель Ку-лихорадки – внутриклеточный патоген Coxiella burnetii – распространен практически по всему миру; в его циркуляции участвует множество видов кровососущих клещей, опасных для животных и человека. С помощью молекулярно-генетических методов обнаружены близкородственные виды микроорганизмов рода Coxiella sp., ряд которых является эндосимбионтами клещей, а некоторые могут выживать в организме человека, вызывая инфекционный процесс. Существование видов, гены которых по нуклеотидной последовательности сходны с генами C. burnetii, затрудняет генодиагностику патогена у членистоногих переносчиков. Цель данной работы – изучение возможности применения ПЦР для молекулярной диагностики и секвенирования протяженного фрагмента гена 16S рРНК для дифференциации C. burnetii от Coxiella-подобных микроорганизмов. Материалы и методы. Индивидуальные пробы кровососущих клещей исследовали для обнаружения бактерий рода Coxiella sp. с помощью стандартной ПЦР. Для положительных образцов получали протяженные фрагменты гена 16S рРНК и исследовали его с помощью секвенирования и множественного выравнивания с гомологичными последовательностями. Результаты и обсуждение. Из 96 исследованных клещей, собранных на территории Ульяновской области, один был положителен на присутствие ДНК C. burnetii и один – на присутствие ДНК Coxiella sp. Для изолята C. burnetii наибольшее сходство выявлено с западноевропейскими штаммами, для Coxiella-подобного микроорганизма – с близкородственными бактериями из клещей того же вида. Отмечены уникальные полиморфизмы для обнаруженных микроорганизмов. Установлено, что родоспецифичные праймеры к фрагменту гена 16S рРНК способны амплифицировать не только бактерии рода Coxiella sp., но и генетически дистанцированные виды. Анализ последовательности протяженного фрагмента гена 16S рРНК позволяет дифференцировать C. burnetii от Coxiella-подобных микроорганизмов; некоторые полиморфизмы гена, по-видимому, возникли в процессе микроэволюции в различных географических регионах. В европейской части Российской Федерации Coxiella-подобные бактерии обнаружены впервые.

The causative agent of Q fever, the intracellular pathogen Coxiella burnetii, is found almost worldwide; many types of blood-sucking ticks that are dangerous to animals and humans are involved in the circulation of the pathogen. Using molecular-genetic methods, closely related species of microorganisms of the genus Coxiella sp. have been discovered, some of which are endo-symbionts of ticks, and some can survive in the human body, causing an infectious process. The existence of species whose genes are similar in nucleotide sequence to those of C. burnetii makes it difficult to diagnose the pathogen in arthropod vectors. The aim of this work was to consider the use of PCR and sequencing of an extended 16S rRNA gene fragment for molecular diagnostics and differentiation of C. burnetii from Coxiella-like microorganisms. Materials and methods. Individual samples of blood-sucking ticks were examined to detect bacteria of the genus Coxiella sp. applying standard PCR. For positive samples, an extended fragment of the 16S rRNA gene was obtained and examined by sequencing and multiple alignment with homologous sequences. Results and discussion. Of the 96 examined ticks collected in the Ulyanovsk Region, one was positive for the presence of C. burnetii DNA and one – for the presence of Coxiella sp. The greatest similarity for the C. burnetii isolate was noted in comparison with Western European strains, for the Coxiella-like microorganism - with closely related bacteria from ticks of the same species. Unique polymorphisms for the detected microorganisms were identified. It has been established that genus-specific primers to the 16S rRNA gene fragment are able to amplify not only bacteria of the genus Coxiella sp., but also genetically distant species. Analysis of the sequence of the extended 16S rRNA gene fragment makes it possible to differentiate C. burnetii from Coxiella-like microorganisms; some gene polymorphisms appear to have arisen through microevolution in different geographic regions. In the European part of the Russian Federation, Coxiella-like bacteria have been uncovered for the first time.

Coxiella burnetiiCoxiella-подобные микроорганизмыкровососущие клещиПЦРген 16S рРНКполиморфизмыCoxiella burnetiiCoxiella-like microorganismsblood-sucking ticksPCR16S rRNA genepolymorphismsReferencesSpitalska E., Kocianova E. Tick-borne microorganisms in southwestern Slovakia. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:196–200. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07362.x.Spitalska E., Kocianova E. Tick-borne microorganisms in southwestern Slovakia. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:196–200. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07362.x.Mediannikov O., Ivanov L., Nishikawa M., Saito R., Sidelnikov Y.N., Zdanovskaya N.I., Tarasevich I.V., Suzuki H. Molecular evidence of Coxiella-like microorganism harbored by Haemaphysalis concinnae ticks in the Russian Far East. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:226–8. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07367.x.Mediannikov O., Ivanov L., Nishikawa M., Saito R., Sidelnikov Y.N., Zdanovskaya N.I., Tarasevich I.V., Suzuki H. Molecular evidence of Coxiella-like microorganism harbored by Haemaphysalis concinnae ticks in the Russian Far East. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:226–8. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07367.x.Lee J.H., Park H.S., Jang W.J., Koh S.E., Park T.K., Kang S.S., Kim B.J., Kook Y.H., Park K.H., Lee S.H. Identification of the Coxiella sp. detected from Haemaphysalis longicornis ticks in Korea. Microbiol. Immunol. 2004; 48(2):125–30. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2004.tb03498.x.Lee J.H., Park H.S., Jang W.J., Koh S.E., Park T.K., Kang S.S., Kim B.J., Kook Y.H., Park K.H., Lee S.H. Identification of the Coxiella sp. detected from Haemaphysalis longicornis ticks in Korea. Microbiol. Immunol. 2004; 48(2):125–30. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2004.tb03498.x.Zhong J. Coxiella-like endosymbionts. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 984:365–79. DOI: 10.1007/978-94-007-4315-1_18.Zhong J. Coxiella-like endosymbionts. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 984:365–79. DOI: 10.1007/978-94-007-4315-1_18.Guimard T., Amrane S., Prudent Е., El Karkouri K., Raoult D., Angelakis E. Case report: Scalp eschar and neck lymphadenopathy associated with bacteremia due to Coxiella-like bacteria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2017; 97(5):1319–22. DOI: 10.4269/ajtmh.17-0251.Guimard T., Amrane S., Prudent Е., El Karkouri K., Raoult D., Angelakis E. Case report: Scalp eschar and neck lymphadenopathy associated with bacteremia due to Coxiella-like bacteria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2017; 97(5):1319–22. DOI: 10.4269/ajtmh.17-0251.Duron O. The IS1111 insertion sequence used for detection of Coxiella burnetii is widespread in Coxiella-like endosymbionts of ticks. FEMS Microbiol. Lett. 2015; 362(17):fnv132. DOI: 10.1093/femsle/fnv132.Duron O. The IS1111 insertion sequence used for detection of Coxiella burnetii is widespread in Coxiella-like endosymbionts of ticks. FEMS Microbiol. Lett. 2015; 362(17):fnv132. DOI: 10.1093/femsle/fnv132.Duron O., Jourdain E., McCoy K.D. Diversity and global distribution of the Coxiella intracellular bacterium in seabird ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2014; 5(5):557–63. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2014.04.003.Duron O., Jourdain E., McCoy K.D. Diversity and global distribution of the Coxiella intracellular bacterium in seabird ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2014; 5(5):557–63. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2014.04.003.Špitalská E., Sparagano O., Stanko M., Schwarzová K., Špitalský Z., Škultéty L., Havlíková S.F. Diversity of Coxiella-like and Francisella-like endosymbionts, and Rickettsia spp., Coxiella burnetii as pathogens in the tick populations of Slovakia, Central Europe. Ticks Tick Borne Dis. 2018; 9(5):1207–11. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2018.05.002.Špitalská E., Sparagano O., Stanko M., Schwarzová K., Špitalský Z., Škultéty L., Havlíková S.F. Diversity of Coxiella-like and Francisella-like endosymbionts, and Rickettsia spp., Coxiella burnetii as pathogens in the tick populations of Slovakia, Central Europe. Ticks Tick Borne Dis. 2018; 9(5):1207–11. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2018.05.002.Machado-Ferreira E., Vizzoni V.F., Balsemão-Pires E., Moerbeck L., Gazeta G.S., Piesman J., Voloch C.M., Soares C.A. Coxiella symbionts are widespread into hard ticks. Parasitol. Res. 2016; 115(12):4691–9. DOI: 10.1007/s00436-016-5230-z.Machado-Ferreira E., Vizzoni V.F., Balsemão-Pires E., Moerbeck L., Gazeta G.S., Piesman J., Voloch C.M., Soares C.A. Coxiella symbionts are widespread into hard ticks. Parasitol. Res. 2016; 115(12):4691–9. DOI: 10.1007/s00436-016-5230-z.McLaughlin H.P., Cherney B., Hakovirta J.R., Priestley R.A., Conley A., Carter A., Hodge D., Pillai S.P., Weigel L.M., Kersh G.J., Sue D. Phylogenetic inference of Coxiella burnetii by 16S rRNA gene sequencing. PLoS One. 2017; 12(12):e0189910. DOI: 10.1371/journal.pone.0189910.McLaughlin H.P., Cherney B., Hakovirta J.R., Priestley R.A., Conley A., Carter A., Hodge D., Pillai S.P., Weigel L.M., Kersh G.J., Sue D. Phylogenetic inference of Coxiella burnetii by 16S rRNA gene sequencing. PLoS One. 2017; 12(12):e0189910. DOI: 10.1371/journal.pone.0189910.Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсемейства Ixodinae. Фауна СССР . Паукообразные. Т. 4. Вып. 4. Л.: Наука; 1977. 396 с.Filippova N.A. [Ixodid Ticks of the Subfamily Ixodinae. Fauna of the USSR. Arachnids]. Vol. 4. Issue 4. Leningrad: “Science”; 1977. 396 pMasuzawa T., Sawaki K., Nagaoka H., Akiyama M., Hirai K., Yanagihara Y. Identification of rickettsiae isolated in Japan as Coxiella burnetii by 16S rRNA sequencing. Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 47(3):883–4. DOI: 10.1099/00207713-47-3-883.Masuzawa T., Sawaki K., Nagaoka H., Akiyama M., Hirai K., Yanagihara Y. Identification of rickettsiae isolated in Japan as Coxiella burnetii by 16S rRNA sequencing. Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 47(3):883–4. DOI: 10.1099/00207713-47-3-883.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.Leclerque A., Kleespies R.G. 16S rRNA-, GroEL- and MucZ-based assessment of the taxonomic position of ‘Rickettsiella melolonthae’ and its implications for the organization of the genus Rickettsiella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008; 58(Pt. 4):749–55. DOI: 10.1099/ijs.0.65359-0.Leclerque A., Kleespies R.G. 16S rRNA-, GroEL- and MucZ-based assessment of the taxonomic position of ‘Rickettsiella melolonthae’ and its implications for the organization of the genus Rickettsiella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008; 58(Pt. 4):749–55. DOI: 10.1099/ijs.0.65359-0.Gottlieb Y., Lalzar I., Klasson L. Distinctive genome reduction rates revealed by genomic analyses of two Coxiella-like endosymbionts in ticks. Genome Biol. Evol. 2015; 7(6):1779–96. DOI: 10.1093/gbe/evv108.Gottlieb Y., Lalzar I., Klasson L. Distinctive genome reduction rates revealed by genomic analyses of two Coxiella-like endosymbionts in ticks. Genome Biol. Evol. 2015; 7(6):1779–96. DOI: 10.1093/gbe/evv108.Mehari Y.T., Jason Hayes B., Redding K.S., Mariappan P.V.G., Gunderson J.H., Farone A.L., Farone M.B. Description of ‘Candidatus Berkiella aquae’ and ‘Candidatus Berkiella cookevillensis’, two intranuclear bacteria of freshwater amoebae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016; 66(2):536–41. DOI: 10.1099/ijsem.0.000750.Mehari Y.T., Jason Hayes B., Redding K.S., Mariappan P.V.G., Gunderson J.H., Farone A.L., Farone M.B. Description of ‘Candidatus Berkiella aquae’ and ‘Candidatus Berkiella cookevillensis’, two intranuclear bacteria of freshwater amoebae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016; 66(2):536–41. DOI: 10.1099/ijsem.0.000750.Bojko J., Dunn A.M., Stebbing P.D., van Aerle R., Bacela-Spychalska K., Bean T.P., Urrutia A., Stentiford G.D. ‘Candidatus Aquirickettsiella gammari’ (Gammaproteobacteria: Legionellales: Coxiellaceae): A bacterial pathogen of the freshwater crustacean Gammarus fossarum (Malacostraca: Amphipoda). J. Invertebr. Pathol. 2018; 156:41–53. DOI: 10.1016/j.jip.2018.07.010.Bojko J., Dunn A.M., Stebbing P.D., van Aerle R., Bacela-Spychalska K., Bean T.P., Urrutia A., Stentiford G.D. ‘Candidatus Aquirickettsiella gammari’ (Gammaproteobacteria: Legionellales: Coxiellaceae): A bacterial pathogen of the freshwater crustacean Gammarus fossarum (Malacostraca: Amphipoda). J. Invertebr. Pathol. 2018; 156:41–53. DOI: 10.1016/j.jip.2018.07.010.Papa A., Tsioka K., Kontana A., Papadopoulos C., Giadinis N. Bacterial pathogens and endosymbionts in ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2017; 8(1):31–5. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2016.09.011.Papa A., Tsioka K., Kontana A., Papadopoulos C., Giadinis N. Bacterial pathogens and endosymbionts in ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2017; 8(1):31–5. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2016.09.011.Лубова В.А., Леонова Г.Н., Шутикова А.Л., Бондаренко Е .И. Индикация возбудителя Ку-лихорадки на юге Дальнего Востока. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65(11):724–8. DOI: 10.18821/0869-2084-2020-65-724-728.Lubova V.A., Leonova G.N., Shutikova A.L., Bondarenko E.I. [Indication of the causative agent of Q fever in the south of the Far East]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Clinical Laboratory Вiagnostics]. 2020; 65(11):724–8. DOI: 10.18821/0869-2084-2020-65-724-728

The authors declare that there are no conflicts of interest present.