microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2014-4-39-42microbe-183Research ArticleМИКРОБИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКАMICROBIOLOGY, DIAGNOSTICSНизкотемпературная консервация коллекционных штаммов холерных вибрионовLow-Temperature Conservation of Collection Cholera Vibrio StrainsГрачеваИ. В.GrachevaI. V.rusrapi@microbe.ruОсинА. В.OsinA.V. Lowrusrapi@microbe.ruРоссийский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201420122014043942Copyright © Грачева И.В., Осин А.В., 20142014Грачева И.В., Осин А.В.Gracheva I.V., Osin A.L.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/183

Целью исследования является оценка устойчивости холерных вибрионов к замораживанию и хранению в замороженном состоянии при -70 °С в присутствии криопротекторов. В работе представлены результаты хранения семи штаммов V. cholerae в течение трех лет в пяти защитных средах, содержащих в качестве криопротектора глицерин или лактозу (10, 20, 30 % водные растворы глицерина, мясопептонный бульон с 10 % глицерина, среда с 15 % лактозы и 3 % желатина). Показано, что гибель холерных вибрионов происходит при замораживании-размораживании образцов и их хранении. После трех лет консервации количество живых клеток уменьшилось во всех средах, но в разной степени. Наиболее высокая выживаемость холерных вибрионов после замораживания-размораживания и хранения в замороженном состоянии по используемому протоколу отмечена в лактозо-желатиновой среде. При использовании в качестве протективной среды водного раствора глицерина оптимальной является концентрация криопротектора 20 %. После трех лет хранения при -70 °С все штаммы, независимо от состава защитной среды, сохранили основные диагностически значимые фенотипические признаки. Таким образом, холерные вибрионы могут быть сохранены без пересевов в течение трех лет (срок наблюдения) без изменения основных диагностических признаков во всех тестируемых защитных средах при -70 °С.

Objective of the study is to evaluate cholera vibrio resistance to freezing and freeze preservation at -70 °C in the presence of cryoprotectors. The study outlines the results of storage of seven different V. cholerae strains within three-years term in the protective media containing glycerin or lactose (10, 20, 30 % aquatic solutions of glycerin, meat-peptone broth with 10 % of glycerin, a medium with 15 % of lactose and 3 % of gelatin) as cryoprotectors. Demonstrated is the fact that cholera vibrio death occurs during freezing-refreezing procedure and preservation of samples. After three-year conservation the numbers of living cells decrease in all types of media, but to different extent. The highest survival rate in cholera vibrios after freezing-refreezing procedure and freeze preservation in accordance with applicable protocols is observed in lactose-gelatin medium. When using aquatic solution of glycerin as protective medium, optimum turns out to be the cryoprotector concentration equal to 20 %. After three-year preservation at -70 °C all the strains, irrespective of the protective medium composition, retain their basic diagnostically significant phenotypic characteristics. Thus, cholera vibrios can be conserved free from subcultures within three-year term (period of observation) without alterations to their basic diagnostic properties in all tested protective media but at -70 °C.

холерные вибрионызамораживаниенизкотемпературная консервациякриопротекторыжизнеспособностьcholera vibriosfreezinglow-temperature conservationcryoprotectorssurvivabilityReferencesЛабораторная диагностика холеры: Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2007. 87 с.[Laboratory diagnostics of cholera: Methodological recommendations]. M.; 2007. 87 p.Каменских Т.Н., Калашникова Е.А., Ившина И.Б. Особенности криоконсервации алканотрофных актинобактерий рода Rhodococcus. Вестник Пермского университета. 2010; 1(1):15-20.Kamenskikh T.N., Kalashnikova E.A., Ivshina I.B. [Peculiarities of cryo-conservation of alkane-trophic actynobacillus, genus Rhodococcus]. Bulletin of the Perm’University. 2010; 1(1):15–20.Цуцаева А.А., Ананьина А.Е., Балыбердина Л.М., Степанюк Л.В., Павленко Н.В. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов. Микробиология. 2008; 77(5):696-700.Tsutsaeva A.A., Anan’ina A.E., Balyberdina L.M., Stepanyuk L.V., Pavlenko N.V. [Experience in long-term conservation of commercial microorganism strains]. Mikrobiologia. 2008; 77(5):696–700.Alm R.A., Manning P.A. Biotype-specific probe for Vibrio cholerae serogroup O1. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(4):823-4.Alm R.A., Manning P.A. Biotype-specific probe for Vibrio cholerae serogroup O1. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(4):823–4.Aulet de Saab O.C., de Castillo M.C., de Ruiz Holgado A.P., de Nader O.M. A comparative study of preservation and storage of Haemophilus influenzae. Mem. Inst. Oswaldo Cruze. 2001; 96(4):583-6.Aulet de Saab O.C., de Castillo M.C., de Ruiz Holgado A.P., de Nader O.M. A comparative study of preservation and storage of Haemophilus influenzae. Mem. Inst. Oswaldo Cruze. 2001; 96(4):583–6.Cabri Guidelines. Laboratory procedures of microorganisms. Protective suspension media for freezing or (freeze)-drying (cited 14.04.14). Available from: http://www.cabri.org/guidelines/micro-organisms/M300Ap3.html.Cabri Guidelines. Laboratory procedures of microorganisms. Protective suspension media for freezing or (freeze)-drying (cited 14.04.14). Available from: http://www.cabri.org/guidelines/micro-organisms/M300Ap3.html.Gorman R., Adley C.C. An evaluation of five preservation techniques and conventional freezing temperatures of -20 °C and -85 °C for long-term preservation of Campylobacter jejuni. Lett. Appl. Microbiol. 2004; 38(4):306-10.Gorman R., Adley C.C. An evaluation of five preservation techniques and conventional freezing temperatures of -20 °C and ‑85 °C for long-term preservation of Campylobacter jejuni. Lett. Appl. Microbiol. 2004; 38(4):306–10.De Paoli P. Biobanking in microbiology: From sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol. Rev. 2005; 29(5):897-910.De Paoli P. Biobanking in microbiology: From sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol. Rev. 2005; 29(5):897–910.Dumont F., Marechal P.A., Gervais P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1):268-72.Dumont F., Marechal P.A., Gervais P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1):268–72.Michel C., Garcia C. Virulence stability in Flavobacterium psychrophilum after storage and preservation according to different procedures. Vet. Res. 2003; 34:127-32.Michel C., Garcia C. Virulence stability in Flavobacterium psychrophilum after storage and preservation according to different procedures. Vet. Res. 2003; 34:127–32.Wolfe J., Bryant G. Freezing, drying, and/or vitrification of membrane-solute-water systems. Cryobiology. 1999; 39(2):103-29.Wolfe J., Bryant G. Freezing, drying, and/or vitrification of membrane–solute–water systems. Cryobiology. 1999; 39(2):103–29.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.