microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-3-59-65microbe-1855Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов Francisella tularensis, изолированных в Ростовской области в 2020 г., и последовательностей геномов штаммов, выделенных в различных регионах мираComparative Molecular-Genetic Analysis of Francisella tularensis Strains Isolated in the Rostov Region in 2020 and Genome Sequences of the Strains Collected in Various Regions of the Worldhttps://orcid.org/0000-0002-9056-3231ВодопьяновА. С.Vodop’yanovA. S.

Водопьянов Алексей Сергеевич

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

vodopyanov_as@antiplague.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7178-8021ПисановР. В.PisanovR. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4336-0439ВодопьяновС. О.Vodop’yanovS. O.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4091-649XЦимбалистоваМ. В.TsimbalistovaM. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1876-5397ПичуринаН. Л.PichurinaN. L.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1835-1496СорокинВ. М.SorokinV. M.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8287-4294ПавловичН. В.PavlovichN. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0550-2221НосковА. К.NoskovA. K.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М . Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»РоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian Federation202330092023035965Copyright © Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Цимбалистова М.В., Пичурина Н.Л., Сорокин В.М., Павлович Н.В., Носков А.К., 20232023Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Цимбалистова М.В., Пичурина Н.Л., Сорокин В.М., Павлович Н.В., Носков А.К.Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Vodop’yanov S.O., Tsimbalistova M.V., Pichurina N.L., Sorokin V.M., Pavlovich N.V., Noskov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1855В 2020 г

В 2020 г. при проведении эпизоотологического мониторинга в очаге степного типа на юго-востоке Ростовской области на фоне разлитой эпизоотии в популяциях обыкновенной полевки Microtus arvalis obscurus и общественной полевки Microtus socialis изолировано шесть культур туляремийного микроба от павших и отловленных живыми животных.

Цель работы состояла в разработке схемы SNP-типирования и сравнительном изучении филогенетических связей штаммов Francisella tularensis, изолированных в Ростовской области (2020 г.), со штаммами из других регионов.

Материалы и методы

Материалы и методы. Полногеномное секвенирование проводили на платформе MiSeq Illumina. Для анализа применяли авторское программное обеспечение GeneExpert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Штаммы возбудителя туляремии, выделенные на территории Ростовской области в 2020 г., можно распределить между двумя различными кластерами. Установлено, что два штамма возбудителя туляремии (F0884 и F0889), выделенные на территории Турции, генетически близки к некоторым изолятам, циркулирующим в Ростовской области. Выявлен уникальный INDEL-маркер, характерный для данной группы штаммов. Проведенное сравнение предлагаемой нами схемы типирования со схемой «канонических» SNP показало довольно хорошее схождение результатов в пределах больших кластеров, при этом использование набора из 6626 SNP позволяет дифференцировать штаммы внутри одного canSNP-типа. Выявлено, что вакцинный штамм имеет общий canSNP-тип с клиническими и природными штаммами. Подобран набор SNP-маркеров для проведения сравнительного анализа. Обнаружен новый INDEL-маркер, позволяющий проводить внутривидовое типирование F. tularensis, и доказана возможность его использования in vitro и in silico.

Six cultures of tularemia microbe from fallen and captured live animals were isolated during epizootiological monitoring in the steppe focus in the south-east of the Rostov Region in 2020 against the background of extensive epizootics in the populations of the common vole Microtus arvalis obscurus and the public vole Microtus socialis.

The aim of the work was to develop an SNP-typing scheme and to conduct a comparative study of the phylogenetic relations between Francisella tularensis strains isolated in the Rostov Region (2020) and strains from other regions.

Materials and methods

Materials and methods. Genome-wide sequencing was performed on the MiSeq Illumina platform. The author’s software GeneExpert, PrimerM and VirtualPCR, written in the Java programming language, were used for the analysis.

Results and discussion

Results and discussion. The strains of tularemia agent, isolated on the territory of the Rostov Region in 2020, can be allocated to two different clusters. It is established that two strains of tularemia pathogen (F0884 and F0889) isolated in Turkey are genetically close to some isolates circulating in the Rostov Region. A unique INDEL marker characteristic of this group of strains has been identified. The comparison of our proposed typing scheme with the scheme of “canonical” SNPs has showed a fairly good consistency and convergence of results within large clusters, meanwhile using a set of 6626 SNPs allows for differentiating the strains within one canSNP type. It is revealed that the vaccine strain has a common canSNP type with clinical and natural strains. A set of SNP markers has been selected for comparative analysis. A new INDEL marker that enables intraspecific typing of F. tularensis has been discovered and the possibility of its application in vitro and in silico has been comfirmed.

Francisella tularensisINDELполногеномное секвенированиеПЦРгенотипированиеSNPFrancisella tularensisINDELwhole-genome sequencingPCRgenotypingSNPReferencesSkottman T., Piiparinen H., Hyytiäinen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 26(3):207–11. DOI: 10.1007/s10096-007-0262-z.Skottman T., Piiparinen H., Hyytiäinen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 26(3):207–11. DOI: 10.1007/s10096-007-0262-z.Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Куликалова Е.С., Холин А.В., Мазепа А.В., Транквилевский Д.В., Храмов М.В., Дятлов И.А. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по туляремии на территории России в 2020 г., прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:32–42. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-32-42.Kudryavtseva T.Yu., Popov V.P., Mokrievich A.N., Kholin A.V., Mazepa A.V., Kulikalova E.S., Trankvilevsky D.V., Khramov M.V., Dyatlov I.A. [Epidemiological and epizootiological situation on tularemia in Russia and neighboring countries in 2019, the forecast for 2020]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (1):21–32. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-1-21-32.Sissonen S., Rossow H., Karlsson E., Hemmilä H., Henttonen H., Isomursu M., Kinnunen P.M., Pelkola K., Pelkonen S., Tarkka E., Myrtennäs K., Nikkari S., Forsman M. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica in Finland, 1993–2011. Infect. Dis. (Lond). 2015; 47(10):701–6. DOI: 10.3109/23744235.2015.1049657.Sissonen S., Rossow H., Karlsson E., Hemmilä H., Henttonen H., Isomursu M., Kinnunen P.M., Pelkola K., Pelkonen S., Tarkka E., Myrtennäs K., Nikkari S., Forsman M. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica in Finland, 1993–2011. Infect. Dis. (Lond). 2015; 47(10):701–6. DOI: 10.3109/23744235.2015.1049657.Водопьянов А.С., Павлович Н.В., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю., Пичурина Н.Л., Мишанькин Б.Н. Генотипирование методом мультилокусного VNTR-анализа штаммов Francisella tularensis, выделенных из природных очагов туляремии Ростовской области. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004; 2:24–8.Vodop’yanov A.S., Pavlovich N.V., Vodop’yanov S.O., Suchkov I.Yu., Pichurina N.L., Mishan’kin B.N. [Genotyping of Francisella tularensis strains isolated from natural foci of tularemia in the Rostov Region using multilocus VNTR analysis]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2004; (2):24–8.Водопьянов А.С., Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю. VNTR-генотипирование штаммов Francisella tularensis, выделенных на территории бывшего СССР и некоторых стран Европы во время эпизоотий 1988–1989 годов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006; 3:22–7.Vodop’yanov A.S., Mishan’kin B.N., Pavlovich N.V., Vodop’yanov S.O., Suchkov I.Yu. [VNTR genotyping of Francisella tularensis strains isolated on the territory of the former USSR and some European countries during epizootics of 1988–1989]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2006; (3):22–7.Pandya G.A., Holmes M.H., Petersen J.M., Pradhan S., Karamycheva S.A., Wolcott M.J., Molins C., Jones M., Schriefer M.E., Fleischmann R.D., Peterson S.N. Whole genome single nucleotide polymorphism based phylogeny of Francisella tularensis and its application to the development of a strain typing assay. BMC Microbiol. 2009; 9:213. DOI: 10.1186/1471-2180-9-213.Pandya G.A., Holmes M.H., Petersen J.M., Pradhan S., Karamycheva S.A., Wolcott M.J., Molins C., Jones M., Schriefer M.E., Fleischmann R.D., Peterson S.N. Whole genome single nucleotide polymorphism based phylogeny of Francisella tularensis and its application to the development of a strain typing assay. BMC Microbiol. 2009; 9:213. DOI: 10.1186/1471-2180-9-213.Vogler A.J., Birdsell D., Price L.B., Bowers J.R., Beckstrom-Sternberg S.M., Auerbach R.K., Beckstrom-Sternberg J.S., Johansson A., Clare A., Buchhagen J.L., Petersen J.M., Pearson T., Vaissaire J., Dempsey M.P., Foxall P., Engelthaler D.M., Wagner D.M., Keim P. Phylogeography of Francisella tularensis: global expansion of a highly fit clone. J. Bacteriol. 2009; 191(8):2474–84. DOI: 10.1128/JB.01786-08.Vogler A.J., Birdsell D., Price L.B., Bowers J.R., Beckstrom-Sternberg S.M., Auerbach R.K., Beckstrom-Sternberg J.S., Johansson A., Clare A., Buchhagen J.L., Petersen J.M., Pearson T., Vaissaire J., Dempsey M.P., Foxall P., Engelthaler D.M., Wagner D.M., Keim P. Phylogeography of Francisella tularensis: global expansion of a highly fit clone. J. Bacteriol. 2009; 191(8):2474–84. DOI: 10.1128/JB.01786-08.Karlsson E., Svensson K., Lindgren P., Byström M., Sjödin A., Forsman M., Johansson A. The phylogeographic pattern of Francisella tularensis in Sweden indicates a Scandinavian origin of Eurosiberian tularaemia. Environ. Microbiol. 2013; 15(2):634–45. DOI: 10.1111/1462-2920.12052.Karlsson E., Svensson K., Lindgren P., Byström M., Sjödin A., Forsman M., Johansson A. The phylogeographic pattern of Francisella tularensis in Sweden indicates a Scandinavian origin of Eurosiberian tularaemia. Environ. Microbiol. 2013; 15(2):634–45. DOI: 10.1111/1462-2920.12052.Kevin M., Girault G., Caspar Y., Cherfa M.A., Mendy C., Tomaso H., Gavier-Widen D., Escudero R., Maurin M., Durand B., Ponsart C., Madani N. Phylogeography and genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in France (1947–2018). Front. Microbiol. 2020; 11:287. DOI: 10.3389/fmicb.2020.00287.Kevin M., Girault G., Caspar Y., Cherfa M.A., Mendy C., Tomaso H., Gavier-Widen D., Escudero R., Maurin M., Durand B., Ponsart C., Madani N. Phylogeography and genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in France (1947–2018). Front. Microbiol. 2020; 11:287. DOI: 10.3389/fmicb.2020.00287.Кудрявцева Т.Ю., Мокриевич А.Н. Молекулярно-генетические основы различий подвидов возбудителя туляремии и типирования штаммов Francisella tularensis subsp. holarctica. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2022; 40(1):12–20. DOI: 10.17116/molgen20224001112.Kudryavtseva T.Yu, Mokrievich A.N. [Molecular genetic basis of differences in tularemia causative agent subspecies and typing of strains of Francisella tularensis subsp. holarctica]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2022; 40(1):12–20. DOI: 10.17116/molgen20224001112.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28(10):2731–9. DOI: 10.1093/molbev/msr121.Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28(10):2731–9. DOI: 10.1093/molbev/msr121.Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Johansson A., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Johansson A., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Олейников И.П. Совершенствование методики SNP-типирования штаммов Vibrio cholerae на основе анализа первичных данных полногеномного секвенирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(6):587–93. DOI: 10.36233/0372-9311-2020-97-6-9.Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Vodop’yanov S.O., Oleinikov I.P. [Improvement of the method of SNP-typing of Vibrio cholerae strains based on the analysis of primary data of whole-genome sequencing]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2020; 97(6):587–93. DOI: 10.36233/0372-9311-2020-97-6-9.Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В. Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ . Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 2:91–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.Naryshkina E.A., Krasnov Y.M., Alhova Z.V., Badanin D.V., Osin A.V., Lyashova O.Yu., Sayapina L.V., Bondarev V.P., Merkulov V.A., Olefir Yu.V., Kutyrev V.V. [Whole-genome sequencing and phylogenetic analysis of Francisella tularensis vaccine strain 15 NIIEG]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (2):91–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.Цимбалистова М.В., Сорокин В.М., Аронова Н.В., Анисимова А.С., Пичурина Н.Л., Пасюкова Н.И., Селянская Н.А., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Павлович Н.В., Ковалев Е.В., Носков А.К. Биологические свойства и генетическая характеристика штаммов Francisella tularensis, изолированных на территории Ростовской области в 2020 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 3:134–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-3-134-140.Tsimbalistova M.V., Sorokin V.M., Aronova N.V., Anisimova A.S., Pichurina N.L., Pasyukova N.I., Selyanskaya N.A., Vodop’yanov S.O., Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Pavlovich N.V., Kovalev E.V., Noskov A.K. [Biological properties and genetic characteristics of Francisella tularensis strains isolated in the territory of the Rostov Region in 2020]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; (3):134–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-3-134-140.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.