microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2023-4-42-49microbe-1895Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПрименение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцеллUse of HRM-Analysis of the Melting Curves Obtained after Amplification of VNTR-Loci for Identification and Differentiation of Brucella Strainshttps://orcid.org/0000-0002-0416-6193АнисимоваЕ. А.AnisimovaE. A.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

elizaveta-real@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4709-314XМиргазовД. А.MirgazovD. A.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

vnivi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6919-4064ДодоноваЕ. А.DodonovaE. A.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

vnivi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0802-435XЕлизароваИ. А.ElizarovaI. A.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

vnivi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4446-4619ПанковаЕ. В.PankovaE. V.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

vnivi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2763-8605ОсянинК. А.OsyaninK. A.

420075, Казань, Научный городок-2

Academic Town-2, Kazan, 420075

vnivi@mail.ruФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological SafetyRussian Federation202307012024044249Copyright © Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А., 20242024Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А.Anisimova E.A., Mirgazov D.A., Dodonova E.A., Elizarova I.A., Pankova E.V., Osyanin K.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1895

Цель исследования – оценка эффективности анализа кривых плавления высокого разрешения, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл.

Материалы и методы

Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовали 16 штаммов бруцелл видов Brucella canis (n=1), B. abortus (n=9), B. melitensis (n=2) и B. suis (n=4) различного географического происхождения. MLVA-типирование проводили методом классической ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле и методом ПЦР-РВ с пост-амплификационным анализом кривых плавления VNTR-локусов в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen. Биоинформационный анализ выполняли с помощью программ Vector NTI 9.1 и Mega 11 (алгоритм MUSCLE). Филогенетический анализ проводили методом UPGMA с помощью программы Mega 11.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. С помощью MLVA-подхода, основанного на анализе кривых плавления ПЦР-продуктов, полученных после амплификации VNTR-локусов, показано, что каждый из 16 штаммов бруцелл характеризуется уникальным профилем температур плавления. Методом ПЦР с последующим электрофорезом установлено, что, несмотря на высокую вариабельность использованных VNTR-последовательностей (h=0,48…0,74), только пост-амплификационные кривые плавления локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 обладали достаточной информативностью для определения генетического полиморфизма исследованных штаммов бруцелл. На основании филогенетического анализа последовательностей Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 показано, что большинство исследуемых штаммов бруцелл распределялись на дендрограмме в соответствии с их таксономическим и географическим положением. Таким образом, HRM-анализ кривых плавления, полученных после амплификации локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21, имеет потенциал использования для дифференциации штаммов бруцелл.

The aim of the present study was to evaluate the effectiveness of analysis of the high resolution melting curves obtained after amplification of VNTR loci for the identification and differentiation of Brucella strains.

Materials and methods

Materials and methods. 16 strains of Brucella species – B. canis (n=1), B. abortus (n=9), B. melitensis (n=2), B. suis (n=4) – of different geographical origin were used as objects of the research. The MLVA-typing was performed using conventional PCR followed by separation of amplicons in agarose gel and real-time PCR with post-amplification analysis of the curves of VNTR loci melting in the presence of intercalating dye SybrGreen. Bioinformatics analysis was conducted with the help of Vector NTI 9.1, Mega 11 software (MUSCLE algorithm). Phylogenetic analysis was carried out applying UPGMA method using the Mega 11 program.

Results and discussion

Results and discussion. MLVA approach based on the analysis of the melting point curves of the obtained after amplification of VNTR-loci PCR fragments has shown that each of the 16 strains of Brucella is characterized by a unique melting temperature profile. PCR followed by electrophoresis has demonstrated that despite the high variability of the used VNTR sequences (h=0.48…0.74), only post-amplification melting curves of the Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 loci had sufficient information content to determine the genetic polymorphism of the studied Brucella strains. Based on the results of phylogenetic analysis of the Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 sequences, it has been found that the majority of the studied Brucella strains are distributed in the dendrogram in accordance with their taxonomic and geographical position. Thus, HRM analysis of melting curves obtained after amplification of the Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 loci has the potential to be used for differentiating Brucella strains.

бруцеллезBrucella canisB. suisB. melitensisB. abortusПЦРMLVAкривые плавленияbrucellosisBrucella canisB. suisB. melitensisB. abortusPCRMLVAmelting curvesReferencesEl-Sayed A., Awad W. Brucellosis: Evolution and expected comeback. Int. J. Vet. Sci. Med. 2018; 6(Suppl.):S31–S35. DOI: 10.1016/j.ijvsm.2018.01.008.El-Sayed A., Awad W. Brucellosis: Evolution and expected comeback. Int. J. Vet. Sci. Med. 2018; 6(Suppl.):S31–S35. DOI: 10.1016/j.ijvsm.2018.01.008.Пономаренко Д.Г., Скударева О.Н., Хачатурова А.А., Лукашевич Д.Е., Жаринова И.В., Даурова А.В., Германова А.Н., Логвиненко О.В., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Манин Е.А., Малецкая О.В., Куличенко А.Н. Бруцеллез: тенденции развития ситуации в мире и прогноз на 2022 г. в Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 2:36–45. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-36-45.Ponomarenko D.G., Skudareva O.N., Khachaturova A.A., Lukashevich D.E., Zharinova I.V., Daurova A.V., Germanova A.N., Logvinenko O.V., Rakitina E.L., Kostyuchenko M.V., Manin E.A., Maletskaya O.V., Kulichenko A.N. [Brucellosis: trends in the development of situation in the world and forecast for 2022 in the Russian Federation]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; (2):36–45. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-36-45.Suárez-Esquivel M., Chaves-Olarte E., Moreno E., Guzmán-Verri C. Brucella genomics: Macro and micro evolution. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(20):7749. DOI: 10.3390/ijms21207749.Suárez-Esquivel M., Chaves-Olarte E., Moreno E., Guzmán-Verri C. Brucella genomics: Macro and micro evolution. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(20):7749. DOI: 10.3390/ijms21207749.Писаренко С.В., Ковалев Д.А., Хачатурова А.А., Волынкина А.С., Русанова Д.В., Куличенко А.Н. Филогеография штаммов Brucella melitensis на основе анализа SNP полных геномов. Бактериология. 2016; 1(1):73–9. DOI: 10.20953/2500-1027-2016-1-73-79.Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Khachaturova A.A., Volynkina A.S., Rusanova D.V., Kulichenko A.N. [Phylogeography of Brucella melitensis strains based on SNP analysis of complete genomes]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2016; 1(1):73–9. DOI: 10.20953/2500-1027-2016-1-73-79.Насибуллин Р.Ю., Тухватуллина Л.А., Богова Я.А., Сафина Г.М., Косарев М.А. Бруцеллез: его распространение и профилактика. Ветеринарный врач. 2021; 1:38–43. DOI: 10.33632/1998-698x.2021-1-38-44.Nasibullin R.Yu., Tukhvatullina L.A., Bogova Ya.A., Safina G.M., Kosarev M.A. [Brucellosis: its distirution and prevention]. Veterinarny Vrach [Veterinarian] 2021; (1):38–43. DOI: 10.33632/1998-698x.2021-1-38-44.Liu Z.-G., Di D.-D., Wang M., Liu R.-H., Zhao H.-Y., Piao D.-R., Tian G.-Z., Fan W.-X., Jiang H., Cui B.-Y., Xia X.-Z. MLVA genotyping characteristics of human Brucella melitensis isolated from Ulanqab of Inner Mongolia, China. Front. Microbiol. 2017; 8:6. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00006.Liu Z.-G., Di D.-D., Wang M., Liu R.-H., Zhao H.-Y., Piao D.-R., Tian G.-Z., Fan W.-X., Jiang H., Cui B.-Y., Xia X.-Z. MLVA genotyping characteristics of human Brucella melitensis isolated from Ulanqab of Inner Mongolia, China. Front. Microbiol. 2017; 8:6. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00006.Шакирова Л.И., Ляпустина Л.В., Головнева С.И., Швецова Н.М. Применение молекулярно-генетических методов для характеристики клинических изолятов бруцеллезного микроба. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 2:54–9.Shakirova L.I., Lyapustina L.V., Golovneva S.I., Shvetsova N.M. [Application of molecular-genetic methods to cha¬ racterize clinical isolates of brucellosis microbe]. Epidemiologiya i Vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2014; (2):54–9.Кузнецова И.В., Ковалев Д.А., Евченко Ю.М., Шакирова Л.И., Швецова Н.М., Пономаренко Д.Г., Писаренко С.В., Жиров А.М., Лукина А.А., Куличенко А.Н. Изучение генетического разнообразия штаммов бруцелл, выделенных в Северо-Кавказском федеральном округе. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 3:58–62. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-58-62.Kuznetsova I.V., Kovalev D.A., Evchenko Yu.M., Shakirova L.I., Shvetsova N.M., Ponomarenko D.G., Pisarenko S.V., Zhirov A.M., Lukina A.A., Kulichenko A.N. [The study of genetic diversity of brucella strains isolated in the North-Caucasian Federal District]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; (3):58–62. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-58-62.Хачатурова А.А., Пономаренко Д.Г., Ковалев Д.А., Германова А.Н., Лукашевич Д.Е., Русанова Д.В., Сердюк Н.С., Семенко О.В., Жиров А.М., Катунина Л.С., Куличенко А.Н. Анализ заболеваемости людей бруцеллёзом и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Brucella melitensis на длительно неблагополучных по бруцеллёзу территориях юга европейской части России. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022; 99(1):63–74. DOI: 10.36233/0372-9311-185.Khachaturova A.A., Ponomarenko D.G., Kovalev D.A., Germanova A.N., Lukashevich D.E., Rusanova D.V., Serdyuk N.S., Semenko O.V., Zhirov A.M., Katunina L.S., Kulichenko A.N. [Analysis of human brucellosis incidence and molecular-biological characteristics of Brucella melitensis isolates on long-term brucellosis-affected areas in the south of the European part of Russia]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2022; 99(1):63– 74. DOI: 10.36233/0372-9311-185.Анисимова Е.А., Фахрутдинов Н.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Зайнуллин Л.И., Осянин К.А. Дифференциация штаммов Bacillus anthracis на основе SNP- и VNTR-полиморфизма геномов. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022; 26(6):560–7. DOI: 10.18699/VJGB-22-68.Anisimova E.A., Fakhrutdinov N.A., Mirgazov D.A., Dodonova E.A., Elizarova I.A., Gorbunova M.E., Khammadov N.I., Zainullin L.I., Osyanin K.A. [Differentiation of Bacillus anthracis strains based on SNP-and VNTR-polymorphism of genomes]. Vavilovsky Zhurnal Genetiki i Selektsii [Vavilov Journal of Genetics and Selection]. 2022; 26(6):560–7. DOI: 10.18699/VJGB-22-68.Фахрутдинов Н.А., Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Мустафина Э.Н., Осянин К.А. Дифференциация штаммов Bacillus anthracis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов. Ветеринарный врач. 2023; 2:41–6. DOI: 10.33632/1998-698X_2023_2_41.Fakhrutdinov N.A., Anisimova E.A., Mirgazov D.A., Mustafina E.N., Osyanin K.A. [Differentiation of Bacillus anthracis strains through analyzing the melting temperatures of PCR products obtained after amplification of VNTR loci]. Veterinarny Vrach [Veterinarian]. 2023; (2):41–6. DOI: 10.33632/1998-698X_2023_2_41.Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Хаммадова А.В., Шуралев Э.А. Маркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 3:88–93. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-88-93.Khammadov N.I., Osyanin K.A., Usol’tsev K.V., Faizov T.K., Khammadova A.V., Shuralev E.A. [Marker loci in Brucella genome for differential PCR indication of pathogenic strains]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; (3):88–93. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-88-93.Le Flèche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S., Bouchon P., Denoeud F., Nöckler K., Neubauer H., Guilloteau L.A., Vergnaud G. Evaluation and selection of tandem repeat loci for а Brucella МLVA typing assay. BMC Microbiol. 2006; 6:9. DOI: 10.1186/1471-2180-6-9.Le Flèche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S., Bouchon P., Denoeud F., Nöckler K., Neubauer H., Guilloteau L.A., Vergnaud G. Evaluation and selection of tandem repeat loci for а Brucella МLVA typing assay. BMC Microbiol. 2006; 6:9. DOI: 10.1186/1471-2180-6-9.Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittam T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51(5):873–84. DOI: 10.1128/aem.51.5.873-884.1986.Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittam T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51(5):873–84. DOI: 10.1128/aem.51.5.873-884.1986.Ковалев Д.А., Кузнецова И.В., Жиров А.М., Сердюк Н.С., Жилченко Е.Б., Пономаренко Д.Г., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Куличенко А.Н. Генетическое типирование штаммов Brucella melitensis на основе анализа вариабельности INDEL-локусов. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2022; 12(1):81–6. DOI: 10.18565/epidem.2022.12.1.81-6.Kovalev D.A., Kuznetsova I.V., Zhirov A.M., Serdyuk N.S., Zhilchenko E.B., Ponomarenko D.G., Vodop’yanov A.S., Vodop’yanov S.O., Kulichenko A.N. [Genetic typing of Brucella melitensis strains based on analysis of the variability of INDEL loci]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Aktual’nye Voprosy [Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items]. 2022; 12(1):81–6. DOI: 10.18565/epidem.2022.12.1.81-6.Gopaul K.K., Sells J., Lee R., Beckstrom-Sternberg S.M., Foster J.T., Whatmore A.M. Development and assessment of multiplex high resolution melting assay as a tool for rapid single-tube identification of five Brucella species. BMC Res. Notes. 2014; 7:903. DOI: 10.1186/1756-0500-7-903.Gopaul K.K., Sells J., Lee R., Beckstrom-Sternberg S.M., Foster J.T., Whatmore A.M. Development and assessment of multiplex high resolution melting assay as a tool for rapid single-tube identification of five Brucella species. BMC Res. Notes. 2014; 7:903. DOI: 10.1186/1756-0500-7-903.Girault G., Perrot L., Mick V., Ponsart C. High-resolution melting PCR as rapid genotyping tool for Brucella species. Microorganisms. 2022; 10(2):336. DOI: 10.3390/microorganisms10020336.Girault G., Perrot L., Mick V., Ponsart C. High-resolution melting PCR as rapid genotyping tool for Brucella species. Microorganisms. 2022; 10(2):336. DOI: 10.3390/microorganisms10020336.Алимов А.М., Ахмадеев Р.М., Габидуллина Р.Г., Сазонова Т.Я. Штамм Brucella abortus УФ-1 для приготовления биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Патент РФ № 2425148, опубл. 27.07.2011.Alimov A.M., Akhmadeev R.M., Gabidullina R.G., Sazonova T.Ya. [Brucella abortus strain UV-1 for the production of biological preparations for the diagnosis and specific prevention of brucellosis in farm animals]. RF Patent No. 2425148, publ. Jul 27, 2011.Кулаков Ю.К., Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в различных регионах России. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 4:28–33. DOI: 10.3103/S0891416812040052.Kulakov Yu.K., Tsirel’son L.E., Zheludkov M.M. [Molecular-genetic characteristics of Brucella isolates isolated from dogs and deer in various regions of Russia]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2012; (4):28–33. DOI: 10.3103/S0891416812040052.Guzmán-Verri C., Suárez-Esquivel M., Ruíz-Villalobos N., Zygmunt M.S., Gonnet M., Campos E., Víquez-Ruiz E., Chacón-Díaz C., Aragón-Aranda B., Conde-Álvarez R., Moriyón I., Blasco J.M., Muñoz P.M., Baker K.S., Thomson N.R., Cloeckaert A., Moreno E. Genetic and phenotypic characterization of the etiological agent of canine orchiepididymitis smooth Brucella sp. BCCN84.3. Front. Vet. Sci. 2019; 6:175. DOI: 10.3389/fvets.2019.00175.Guzmán-Verri C., Suárez-Esquivel M., Ruíz-Villalobos N., Zygmunt M.S., Gonnet M., Campos E., Víquez-Ruiz E., Chacón-Díaz C., Aragón-Aranda B., Conde-Álvarez R., Moriyón I., Blasco J.M., Muñoz P.M., Baker K.S., Thomson N.R., Cloeckaert A., Moreno E. Genetic and phenotypic characterization of the etiological agent of canine orchiepididymitis smooth Brucella sp. BCCN84.3. Front. Vet. Sci. 2019; 6:175. DOI: 10.3389/fvets.2019.00175.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.