microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2024-1-182-191microbe-1960Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСинтез генома бактериофага N4Synthesis of the Genome of Bacteriophage N4https://orcid.org/0000-0002-6302-8305ФисуновГ. Ю.FisunovG. Yu.

Фисунов Глеб Юрьевич, 

117246, Москва, Научный проезд, 18

Gleb Yu. Fisunov,

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

g.fisunov@sysbiomed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5389-2776СемашкоТ. А.SemashkoT. A.

117246, Москва, Научный проезд, 18

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

info@sysbiomed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8428-5362ЕвсютинаД. В.EvsyutinaD. V.

117246, Москва, Научный проезд, 18

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

info@sysbiomed.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0021-3957ЦойЕ. А.TsoyE. A.

117246, Москва, Научный проезд, 18

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

info@sysbiomed.ruhttps://orcid.org/0009-0003-1616-2848ХаррасовД. Р.KharrasovD. R.

117246, Москва, Научный проезд, 18

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

info@sysbiomed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1341-3037ГумаюноваК. С.GumayunovaK. S.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0712-8659ТучковИ. В.TuchkovI. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4115-9486НикифоровК. А.NikiforovK. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3117-8229РыбальченкоД. А.Rybal’chenkoD. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3788-3452КутыревВ. В.KutyrevV. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0837-8764ГоворунВ. М.GovorunV. M.

117246, Москва, Научный проезд, 18

18, Nauchny driveway, Moscow, 117246

info@sysbiomed.ruФБУН «Научно-исследовательский институт системной биологии и медицины»РоссияResearch Institute of Systems Biology and MedicineRussian FederationФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20240404202401182191Copyright © Фисунов Г.Ю., Семашко Т.А., Евсютина Д.В., Цой Е.А., Харрасов Д.Р., Гумаюнова К.С., Тучков И.В., Никифоров К.А., Рыбальченко Д.А., Кутырев В.В., Говорун В.М., 20242024Фисунов Г.Ю., Семашко Т.А., Евсютина Д.В., Цой Е.А., Харрасов Д.Р., Гумаюнова К.С., Тучков И.В., Никифоров К.А., Рыбальченко Д.А., Кутырев В.В., Говорун В.М.Fisunov G.Y., Semashko T.A., Evsyutina D.V., Tsoy E.A., Kharrasov D.R., Gumayunova K.S., Tuchkov I.V., Nikiforov K.A., Rybal’chenko D.A., Kutyrev V.V., Govorun V.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/1960

В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры.

Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4.

Материалы и методы

Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры. Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4. Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток V. cholerae. Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома. Ключевые слова: холера, бактериофаг, синтез генома.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома.

At present, bacteriophages are considered as an alternative to antibiotics in prevention and treatment of bacterial infections, in particular cholera.

The aim of the work was to demonstrate a method to obtain synthetic bacteriophage against Vibrio cholerae. Vibriophage N4 was selected as a subject for the study.

Materials and methods

Materials and methods. The genome sequence of vibriophage N4 (38.5 kb) was taken from the NCBI GenBank database. The sequence was divided into gene blocks of 1500–2000 bp. The gene blocks, in turn, were split into oligonucleotides. Sequence partitioning was carried out using the BAC-browser software that we have developed. Oligonucleotides were chemically synthesized; gene blocks were assembled from them. After that, the complete genome of vibriophage N4 was synthesized from the obtained gene blocks. The assembly of the synthetic genome took place in two stages. At the first stage, gene block cassettes of 5–7 pieces with sizes ranging from 7 to 10.5 thousand bp were generated via homologous recombination in yeast. The resulting cassettes were then amplified and used for in vitro assembly using 5’-3’ exonuclease and thermostable DNA polymerase. The resulting preparation was used for electroporation of V. cholerae cells.

Results and discussion

Results and discussion. The synthetic genome of vibriophage N4 was delivered into the V. cholerae strain M818 O1 biovar El Tor using electroporation. As a result, the formation of lytic plaques on the lawn of V. cholerae was observed. The range of technologies we have developed: software for assembly design, enzymes and buffers for the synthesis of gene blocks and their crosslinking by homologous recombination in vitro, the method for producing large-sized assemblies in yeast can be used to obtain artificial bacteriophages with a rational genome design.

холерабактериофагсинтез геномаcholerabacteriophagegenome synthesisРабота финансировалась по заданию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в рамках темы «Создание искусственных клеточных систем» (регистрационный номер 1022040800170-3-1.6.23).ReferencesWHO Report. Cholera – Global situation. 2023. [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/emergencies/diseaseoutbreak-news/item/2023-DON437.WHO Report. Cholera – Global situation. 2023. [Internet]. Available from: https://www.who.int/emergencies/disease-outbreaknews/item/2023-DON437.Аноприенко А.О., Тюрина А.В., Гаевская Н.Е., Погожова М.П. Создание экспериментального профилактического препарата на основе холерных бактериофагов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2020; 16(3):10–3.Anoprienko A.O., Tyurina A.V., Gaevskaya N.E., Pogozhova M.P. [Creation of an experimental prophylactic drug based on cholera bacteriophages]. Vestnik Biotekhnologii i Fiziko-Khimicheskoy Biologii imeni Yu.A. Ovchinnikova [Bulletin of Biotechnology and Physical and Chemical Biology named after Yu.A. Ovchinnikov]. 2020; 16(3):10–3Погожова М.П., Гаевская Н.Е., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Аноприенко А.О., Романова Л.В., Тюрина А.В. Биологические свойства и генетическая харктеристика экспериментальных диагностических бактериофагов Vibrio cholerae. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98(3):290–7. DOI: 10.36233/0372-9311-39.Pogozhova M.P., Gaevskaya N.E., Vodop’yanov A.S., Pisanov R.V., Anoprienko A.O., Romanova L.V., Tyurina A.V. [Biological properties and genetic characteristics of experimental diagnostic bacteriophages of Vibrio cholerae]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2021; 98(3):290–7. DOI: 10.36233/0372-9311-39.Smith H.O., Hutchison C.A. 3rd, Pfannkoch C., Venter J.C. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: φX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003; 100(26):15440–5. DOI: 10.1073/pnas.2237126100.Smith H.O., Hutchison C.A. 3rd, Pfannkoch C., Venter J.C. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: φX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003; 100(26):15440–5. DOI: 10.1073/pnas.2237126100.Lartigue C., Vashee S., Algire M.A., Chuang R.-Y., Benders G.A., Ma L., Noskov V.N., Denisova E.A., Gibson D.G., Assad-Garcia N., Alperovich N., Thomas D.W., Merryman C., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C., Glass J.I. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. Science. 2009; 325(5948):1693–6. DOI: 10.1126/science.1173759.Lartigue C., Vashee S., Algire M.A., Chuang R.-Y., Benders G.A., Ma L., Noskov V.N., Denisova E.A., Gibson D.G., AssadGarcia N., Alperovich N., Thomas D.W., Merryman C., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C., Glass J.I. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. Science. 2009; 325(5948):1693–6. DOI: 10.1126/science.1173759.Cheng L., Deng Z., Tao H., Song W., Xing B., Liu W., Kong L., Yuan S., Ma Y., Wu Y., Huang X., Peng Y., Wong N.K., Liu Y., Wang Y., Shen Y., Li J., Xiao M. Harnessing stepping-stone hosts to engineer, select, and reboot synthetic bacteriophages in one pot. Cell Rep. Methods. 2022; 2(5):100217. DOI: 10.1016/j.crmeth.2022.100217.Cheng L., Deng Z., Tao H., Song W., Xing B., Liu W., Kong L., Yuan S., Ma Y., Wu Y., Huang X., Peng Y., Wong N.K., Liu Y., Wang Y., Shen Y., Li J., Xiao M. Harnessing stepping-stone hosts to engineer, select, and reboot synthetic bacteriophages in one pot. Cell Rep. Methods. 2022; 2(5):100217. DOI: 10.1016/j.crmeth.2022.100217.Das M., Nandy R.K., Bhowmick T.S., Yamasaki S., Ghosh A., Nair G.B., Sarkar B.L. Vibrio cholerae typing phage N4: genome sequence and its relatedness to T7 viral supergroup. Intervirology. 2012; 55(3):185–93. DOI: 10.1159/000323525.Das M., Nandy R.K., Bhowmick T.S., Yamasaki S., Ghosh A., Nair G.B., Sarkar B.L. Vibrio cholerae typing phage N4: genome sequence and its relatedness to T7 viral supergroup. Intervirology. 2012; 55(3):185–93. DOI: 10.1159/000323525.Семашко Т.А., Фисунов Г.Ю., Цой Е.А., Харрасов Д.Р., Чудинов И.К., Евсютина Д.В., Шевелёв Г.Ю., Говорун В.М. Современные подходы к de novo синтезу протяженных фрагментов ДНК: сборка широкого репертуара последовательностей. Acta Naturae. 2024; 16(1).Semashko T.A., Fisunov G.Yu., Tsoi E.A., Kharrasov D.R., Chudinov I.K., Evsyutina D.V., Shevelev G.Yu., Govorun V.M. [Modern approaches to de novo synthesis of extended DNA fragments: assembly of a wide repertoire of sequences]. Acta Naturae. 2024; 16(1).Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 1983; 153(1):163–8. DOI: 10.1128/jb.153.1.163-168.1983.Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 1983; 153(1):163–8. DOI: 10.1128/jb.153.1.163-168.1983.Gonzales M.F., Brooks T., Pukatzki S.U., Provenzano D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. 2013; (80):6–11. DOI: 10.3791/50684.Gonzales M.F., Brooks T., Pukatzki S.U., Provenzano D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. 2013; (80):6–11. DOI: 10.3791/50684.Литусов Н.В. Бактериофаги: иллюстрированное учебное пособие. Екатеринбург: УГМА; 2012. 38 с.Litusov N.V. [Bacteriophages: an Illustrated Textbook]. Yekaterinburg: Ural State Medical Academy; 2012. 38 p.Tamanoi F., Saito H., Richardson C.C. Physical mapping of primary and secondary origins of bacteriophage T7 DNA replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980; 77(5):2656–60. DOI: 10.1073/pnas.77.5.2656.Tamanoi F., Saito H., Richardson C.C. Physical mapping of primary and secondary origins of bacteriophage T7 DNA replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980; 77(5):2656–60. DOI: 10.1073/pnas.77.5.2656.Garanina I.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. BACBROWSER: The tool for visualization and analysis of prokaryotic genomes. Front. Microbiol. 2018; 9:2827. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02827.Garanina I.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. BACBROWSER: The tool for visualization and analysis of prokaryotic genomes. Front. Microbiol. 2018; 9:2827. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02827.Hutchison C.A. 3rd, Chuang R.Y., Noskov V.N., Assad-Garcia N., Deerinck T.J., Ellisman M.H., Gill J., Kannan K., Karas B.J., Ma L., Pelletier J.F., Qi Z.Q., Richter R.A., Strychalski E.A., Sun L., Suzuki Y., Tsvetanova B., Wise K.S., Smith H.O., Glass J.I., Merryman C., Gibson D.G., Venter J.C. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science. 2016; 351(6280):aad6253. DOI: 10.1126/science.aad6253.Hutchison C.A. 3rd, Chuang R.Y., Noskov V.N., AssadGarcia N., Deerinck T.J., Ellisman M.H., Gill J., Kannan K., Karas B.J., Ma L., Pelletier J.F., Qi Z.Q., Richter R.A., Strychalski E.A., Sun L., Suzuki Y., Tsvetanova B., Wise K.S., Smith H.O., Glass J.I., Merryman C., Gibson D.G., Venter J.C. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science. 2016; 351(6280):aad6253. DOI: 10.1126/science.aad6253.BioXpTM 3200 System: User’s Guide. No. 40010. P. 1–25.BioXpTM 3200 System: User’s Guide. No. 40010. P. 1–25.Gibson D.G., Glass J.I., Lartigue C., Noskov V.N., Chuang R.Y., Algire M.A., Benders G.A., Montague M.G., Ma L., Moodie M.M., Merryman C., Vashee S., Krishnakumar R., Assad-Garcia N., Andrews-Pfannkoch C., Denisova E.A., Young L., Qi Z.Q., Segall-Shapiro T.H., Calvey C.H., Parmar P.P., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 2010; 329(5987):52–6. DOI: 10.1126/science.1190719.Gibson D.G., Glass J.I., Lartigue C., Noskov V.N., Chuang R.Y., Algire M.A., Benders G.A., Montague M.G., Ma L., Moodie M.M., Merryman C., Vashee S., Krishnakumar R., Assad-Garcia N., Andrews-Pfannkoch C., Denisova E.A., Young L., Qi Z.Q., SegallShapiro T.H., Calvey C.H., Parmar P.P., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 2010; 329(5987):52–6. DOI: 10.1126/science.1190719.Xia Y., Li K., Li J., Wang T., Gu L., Xun L. T5 exonucleasedependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 2019; 47(3):e15. DOI: 10.1093/nar/gky1169.Xia Y., Li K., Li J., Wang T., Gu L., Xun L. T5 exonucleasedependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 2019; 47(3):e15. DOI: 10.1093/nar/gky1169.Dao V.L., Chan S., Zhang J., Ngo R.K.J., Poh C.L. Single 3’-exonuclease-based multifragment DNA assembly method (SENAX). Sci. Rep. 2022; 12(1):4004. DOI: 10.1038/s41598-02207878-x.Dao V.L., Chan S., Zhang J., Ngo R.K.J., Poh C.L. Single 3’-exonuclease-based multifragment DNA assembly method (SENAX). Sci. Rep. 2022; 12(1):4004. DOI: 10.1038/s41598-022-07878-x.Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Челдышова Н.Б. Анализ антифаговых систем в штаммах Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор. Здоровье населения и среда обитания – ЗНИСО. 2023; 31(11):94–100. DOI: 10.35627/2219-5238/2023-31-11-94-100.Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Spirina A.Yu., Cheldyshova N.B. [Analysis of anti-phage systems in Vibrio cholerae O1 biovar El Tor strains]. Zdorovie Naseleniya i Sreda Obitaniya [Public Health and Life Environment – PHLE]. 2023; 31(11):94–100. DOI: 10.35627/2219-5238/2023-31-11-94-100.Wood D.E., Lu J., Langmead B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 2019; 20(1):257. DOI: 10.1186/s13059-019-1891-0.Wood D.E., Lu J., Langmead B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 2019; 20(1):257. DOI: 10.1186/s13059-019-1891-0.Liu Y., Han Y., Huang W., Duan Y., Mou L., Jiang Z., Fa P., Xie J., Diao R., Chen Y., Ye Y., Yang R., Chen J., Sun X., Li Z., Tang A., Gui Y., Cai Z. Whole-genome synthesis and characterization of viable S13-like bacteriophages. PLoS One. 2012; 7(7):e41124.Liu Y., Han Y., Huang W., Duan Y., Mou L., Jiang Z., Fa P., Xie J., Diao R., Chen Y., Ye Y., Yang R., Chen J., Sun X., Li Z., Tang A., Gui Y., Cai Z. Whole-genome synthesis and characterization of viable S13-like bacteriophages. PLoS One. 2012; 7(7):e41124.Yang R., Han Y., Ye Y., Liu Y., Jiang Z., Gui Y., Cai Z. Chemical synthesis of bacteriophage G4. PLoS One. 2011; 6(11):e27062. DOI: 10.1371/journal.pone.0027062.Yang R., Han Y., Ye Y., Liu Y., Jiang Z., Gui Y., Cai Z. Chemical synthesis of bacteriophage G4. PLoS One. 2011; 6(11):e27062. DOI: 10.1371/journal.pone.0027062.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.