microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2024-2-148-156microbe-2009Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВнутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis с помощью молекулярно-генетических методов. Комплексный подходIntraspecific Differentiation of Francisella tularensis Strains Using Molecular-Genetic Methods. Complex Approachhttps://orcid.org/0000-0003-0954-5683ОсинаН. А.OsinaN. A.

Осина Наталия Александровна, 

 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Natalia A. Osina,

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2766-2624СитмбетовД. А.SitmbetovD. A.

 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruМорозовО. А.MorozovO. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2405-2684БулгаковаЕ. Г.BulgakovaE. G.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5308-0022ОсинА. В.OsinA. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5487-2240ЧекмареваС. С.ChekmarevaS. S.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9140-3910СазановаЕ. В.SazanovaE. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1026-2680СеничкинаА. М.SenichkinaA. M.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1332-9580ЛяшоваО. Ю.LyashovaO. Yu.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2234-2760ПолунинаТ. А.PoluninaT. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4909-2394КрасновЯ. М.KrasnovYa. M.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruДевдарианиЗ. Л.DevdarianiZ. L.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1143-4069ЩербаковаС. А.ShcherbakovaS. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20240307202402148156Copyright © Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Морозов О.А., Булгакова Е.Г., Осин А.В., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Полунина Т.А., Краснов Я.М., Девдариани З.Л., Щербакова С.А., 20242024Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Морозов О.А., Булгакова Е.Г., Осин А.В., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Полунина Т.А., Краснов Я.М., Девдариани З.Л., Щербакова С.А.Osina N.A., Sitmbetov D.A., Morozov O.A., Bulgakova E.G., Osin A.V., Chekmareva S.S., Sazanova E.V., Senichkina A.M., Lyashova O.Y., Polunina T.A., Krasnov Y.M., Devdariani Z.L., Shcherbakova S.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2009

Цель исследования – разработка алгоритма внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя туляремии с использованием комплекса подходов, основанных на амплификационных и секвенационных технологиях.

Материалы и методы

Материалы и методы. В работе использовали 97 штаммов Francisella tularensis различных подвидов, биоваров и субпопуляций. Внутривидовую принадлежность штаммов возбудителя туляремии осуществляли с использованием системы «F. tularensis-4c», анализа вариабельности области дифференциации RD1, гена sdhA, дискодиффузионным методом с использованием дисков с эритромицином. Фрагментное секвенирование по Сэнгеру осуществляли на генетическом анализаторе 3500 XL (Applied Biosystems, США) с учетом рекомендаций производителя. Оценку гомологии последовательностей – по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI, программы MEGA11 v11.0.13 и Unipro UGENE v50.0.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Выявлены подвидо- и биовароспецифичные мутации в гене 23S рРНК. Определены перспективные для изучения участки данного гена с помощью фрагментного секвенирования. Предложена комплексная схема внутривидовой дифференциации штаммов туляремийного микроба, где на первом этапе проводится определение подвидовой принадлежности и биовара japonica, а на втором – верификация полученных результатов на основании определения мутаций в гене 23S рРНК. Эффективность предложенного комплексного подхода подтверждена при исследовании 97 коллекционных штаммов возбудителя туляремии. Проведенные исследования позволяют осуществить быструю идентификацию штаммов разных подвидов туляремийного микроба и верифицировать их таксономическую принадлежность с помощью молекулярно-генетических методов, дополняют данные о циркуляции различных подвидов, биоваров и субпопуляций патогена на территории Европы, Азии и других регионов мира.

The aim of the study was to develop an algorithm for intraspecific differentiation of tularemia agent strains using a set of approaches based on amplification and sequencing technologies.

Materials and methods

Materials and methods. 97 strains of Francisella tularensis of various subspecies, biovars and subpopulations from the State Collection of Pathogenic Bacteria of the Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe” were used in the work. The intraspecific identification of tularemia agent strains was carried out using the “F. tularensis-4c” system; analysis of the variability of the RD1 differentiation region, the sdhA gene, by applying the disk diffusion method using disks with erythromycin. Fragment Sanger sequencing was performed on a 3500 XL genetic analyzer (Applied Biosystems, USA) taking into account the manufacturer’s recommendations. Sequence homology assessment was conducted using the BLAST algorithm, the GenBank NCBI database, MEGA11 v11.0.13 and Unipro UGENE v50.0 software.

Results and discussion

Results and discussion. Subspecies- and biovarspecific mutations have been detected in the 23S rRNA gene. Promising regions of this gene for further investigation have been identified using fragment sequencing. A comprehensive scheme for intraspecific differentiation of tularemia microbe strains has been put forward, where at the first stage the subspecies and biovar japonica are determined, and at the second stage, the results are verified based on the determination of mutations in the 23S rRNA gene. The effectiveness of the proposed integrated approach has been confirmed in a study of 97 collection strains of tularemia agent. The conducted research allows for rapid identification of tularemia agent strains of different subspecies and verification of their taxonomic appurtenance using molecular-genetic methods, expanding data on the circulation of various subspecies, biovars and subpopulations of the pathogen in Europe, Asia and other regions of the world.

внутривидовая дифференциацияFrancisella tularensisбиоварыподвидыалгоритмкомплексный подходамплификационные и секвенационные технологииintraspecific differentiationFrancisella tularensisbiovarssubspeciesalgorithmintegrated approachamplification and sequencing technologiesReferencesОлсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностистика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 190 с.Olsuf’ev N.G. [Taxonomy, Microbiology, and Laboratory Diagnostics of Tularemia Agent]. Moscow: “Medicine”; 1975. 190 p.List of Procariotic Names with Standing in Nomenclature (LPSN). [Электронный ресурс]. URL: http://www.bacterio.net/francisella.html (дата обращения 15.02.2024).List of Procariotic Names with Standing in Nomenclature (LPSN). (Cited 15 Feb 2024). [Internet]. Available from: http://www.bacterio.net/francisella.html.Molins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis A.I and A.II strains. Appl. Environmental. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.Molins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis A.I and A.II strains. Appl. Environmental. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924– 31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924– 31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Булгакова Е.Г., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Осин А.В., Щербакова С.А. Внутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2023; 1:132–41. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-1-132-141.Osina N.A., Sitmbetov D.A., Bulgakova E.G., Chekmareva S.S., Sazanova E.V., Senichkina A.M., Lyashova O.Yu., Osin A.V., Shcherbakova S.A. [Intraspecific differentiation of Francisella tularensis strains using multilocus real-time polymerase chain reaction]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2023; (1):132–41. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-1-132-141.Вахрамеева Г.М., Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР-дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.Vakhrameeva G.M., Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Mironova R.I., Dyatlov I.A. [PCR differentiation of Francisella tularensis subspecies using one primer]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2011; (1):46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(4):e0149519. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(4):e0149519. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.Сорокин В.М., Водопьянов А.С., Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Дифференциация подвидов Francisella tularensis методом INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемио¬ логии и иммунологии. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.Sorokin V.M., Vodop’yanov A.S., Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V. Differentiation of Francisella tularensis subspecies using INDEL typing. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.Biswas S., Raoult D., Rolain J.-M. A bioinformatic approach to understanding antibiotic resistance in intracellular bacteria through whole genome analysis. Int. J. Antimicrob. Agents. 2008; 32(3):207–20. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2008.03.017.Biswas S., Raoult D., Rolain J.-M. A bioinformatic approach to understanding antibiotic resistance in intracellular bacteria through whole genome analysis. Int. J. Antimicrob. Agents. 2008; 32(3):207–20. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2008.03.017.Тимофеев В.С., Мокриевич А.Н., Павлов В.М. Роль нуклеотидных замен в V домене 23S РНК Francisella tularensis в формировании резистентности туляремийного микроба к эритрмицину. В кн.: Куличенко А.Н., редактор. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины: Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. Ставрополь; 2014. С. 112.Timofeev V.S., Mokrievich A.N., Pavlov V.M. [The role of nucleotide substitutions in the V domain of Francisella tularensis 23S RNA in the formation of resistance of tularemia microbe to erythromycin]. In: Kulichenko A.N., editor. [Current Issues of Epidemiology and Preventive Medicine: Materials of the VI All-Russian Scientific and Practical Conference of Young Scientists and Specialists of the Rospotrebnadzor]. Stavropol; 2014. P. 112.Karlsson E., Golovliov I., Lärkeryd A., Granberg M., Larsson E., Öhrman C., Niemcewicz M., Birdsell D., Wagner D.M., Forsman M., Johansson A. Clonality of erythromycin resistance in Francisella tularensis. J. Antimicrob. Chemother. 2016; 71(10):2815–23. DOI: 10.1093/jac/dkw235.Karlsson E., Golovliov I., Lärkeryd A., Granberg M., Larsson E., Öhrman C., Niemcewicz M., Birdsell D., Wagner D.M., Forsman M., Johansson A. Clonality of erythromycin resistance in Francisella tularensis. J. Antimicrob. Chemother. 2016; 71(10):2815–23. DOI: 10.1093/jac/dkw235.Svensson K., Granberg M., Karlsson L., Neubauerova V., Forsman M., Johansson A. A real-time PCR array for hierarchical identification of Francisella isolates. PLoS One. 2009; 4(12):e8360. DOI: 10.1371/journal.pone.0008360.Svensson K., Granberg M., Karlsson L., Neubauerova V., Forsman M., Johansson A. A real-time PCR array for hierarchical identification of Francisella isolates. PLoS One. 2009; 4(12):e8360. DOI: 10.1371/journal.pone.0008360.Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol. Biol. Evol. 2021; 38(7):3022–27. DOI: 10.1093/molbev/msab120.Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol. Biol. Evol. 2021; 38(7):3022–27. DOI: 10.1093/molbev/msab120.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.Rossow H., Sissonen S., Koskela K.A., Kinnunen P.M., Hemmilä H., Niemimaa J., Huitu O., Kuusi M., Vapalahti O., Henttonen H., Nikkari S. Detection of Francisella tularensis in voles in Finland. Vector Borne Zoonotic Dis. 2014; 14(3):193–8. DOI: 10.1089/vbz.2012.1255.Rossow H., Sissonen S., Koskela K.A., Kinnunen P.M., Hemmilä H., Niemimaa J., Huitu O., Kuusi M., Vapalahti O., Henttonen H., Nikkari S. Detection of Francisella tularensis in voles in Finland. Vector Borne Zoonotic Dis. 2014; 14(3):193–8. DOI: 10.1089/vbz.2012.1255.Куделина Р.И., Олсуфьев Н.Г. Чувствительность к антибиотикам группы макролидов и линкомицину возбудителя туляремии голарктической расы. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 1980; 24(1):84–91.Kudelina R.I., Olsuf’ev N.G. [Sensitivity to macrolide antibiotics and lincomycin in the causative agent of tularemia of the holarctic race]. Zhurnal Gigieny, Epidemiologii, Mikrobiologii i Immunologii [Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology and Immunology]. 1980; 24(1):84–91.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.