microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2024-3-144-153microbe-2053Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESГенетическое разнообразие и филогенетическое родство штаммов Vibrio cholerae R-вариантаGenetic Diversity and Phylogenetic Relatedness of R-Variant штаммов Vibrio cholerae Strainshttps://orcid.org/0000-0002-9996-4189ПодойницынаО. А.PodoinitsynaO. A.

Подойницына Оксана Андреевна

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

podoynitcina_oa@antiplague.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8481-6442МироноваЛ. В.MironovaL. V.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-6540-2778КругликовВ. Д.KruglikovV. D.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9890-0960ФедотоваИ. С.FedotovaI. S.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

adm@chumin.irkutsk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4764-6330ГалачьянцЮ. П.Galach’yantsYu. P.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

adm@chumin.irkutsk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9056-3231ВодопьяновА. С.Vodop’yanovA. S.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4676-0377ЛевченкоД. А.LevchenkoD. A.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4472-0264ТемяковаС. Ю.TemyakovaS. Yu.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8358-2880БасовЕ. А.BasovE. A.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

adm@chumin.irkutsk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0674-6159ПономареваА. С.PonomarevaA. S.

Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation

adm@chumin.irkutsk.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0550-2221НосковА. К.NoskovA. K.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

plague@aaanet.ruФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»РоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian FederationФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»РоссияIrkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far EastRussian Federation20240210202403144153Copyright © Подойницына О.А., Миронова Л.В., Кругликов В.Д., Федотова И.С., Галачьянц Ю.П., Водопьянов А.С., Левченко Д.А., Темякова С.Ю., Басов Е.А., Пономарева А.С., Носков А.К., 20242024Подойницына О.А., Миронова Л.В., Кругликов В.Д., Федотова И.С., Галачьянц Ю.П., Водопьянов А.С., Левченко Д.А., Темякова С.Ю., Басов Е.А., Пономарева А.С., Носков А.К.Podoinitsyna O.A., Mironova L.V., Kruglikov V.D., Fedotova I.S., Galach’yants Y.P., Vodop’yanov A.S., Levchenko D.A., Temyakova S.Y., Basov E.A., Ponomareva A.S., Noskov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2053

Среди холерных вибрионов, выделяемых из поверхностных водоемов в процессе мониторинга, встречаются штаммы, отклоняющиеся от типичных по признаку агглютинабельности диагностическими холерными сыворотками, что затрудняет отнесение их к той или иной серогруппе. Поэтому актуальной задачей представляется выявление причин этих отклонений путем изучения структуры генетических детерминант, ответственных за синтез О-антигена (wb* кластеров). Цель работы – идентификация wb* кластеров в геномах Vibrio cholerae R-варианта, изучение их структуры и проведение филогенетического анализа данных штаммов. Материалы и методы. Проведено полногеномное секвенирование (платформы Illumina MiSeq и MinION). Cборка осуществлялась de novo программой-сборщиком SPAdes (v.3.11.1). Манипуляции с последовательностями кластеров и визуализация данных проводились с помощью программы BLAST из пакета ncbi-blast-suite версии 2.13.0, скриптов на языке Python и пакетов pyGenomeViz, Biopython. Филогенетическое дерево построено с использованием программы roary (v.3.13.0). Полногеномное выравнивание проводилось программами nucmer и promer из пакета MUMmer 4 версии 4.0. Результаты и обсуждение. У штаммов холерного вибриона R-варианта установлено наличие в геноме wb* кластеров разных типов, среди которых наиболее часто встречались О23 и О59. Проведено сравнение транслированных аминокислотных последовательностей wb* регионов штаммов R-варианта с аминокислотными последовательностями представленных в базе данных NCBI референсных штаммов. Часть рассмотренных кластеров полностью совпадала с референсными. Для других установлена высокая вариабельность. Филогенетически штаммы группировались преимущественно в соответствии с типом wb* кластера, вне зависимости от S/R-фенотипа. Штаммы V. cholerae R-варианта сложно систематизировать по признаку агглютинабельности, и для определения их патогенного потенциала необходимо использовать молекулярные методы исследования, в частности полимеразную цепную реакцию.

Cholera vibrios, isolated from surface water bodies during monitoring activities, can differ from typical ones in terms of agglutinability with diagnostic cholera sera, which makes it difficult to assign them to a specific serogroup. Therefore, the determination of the causes for these deviations through the study of the structure of genetic determinants responsible for the synthesis of O‑antigen (wb* clusters) is considered a relevant task. The aim of this work was to identify wb* clusters in the genomes of R-variant Vibrio cholerae, study their structure, and conduct phylogenetic analysis of the strains. Materials and methods. Full genome sequencing was performed using Illumina MiSeq and MinION platforms. The assembly was conducted de novo using the SPAdes assembler software (v.3.11.1). Manipulation of cluster sequences and data visualization were carried out using the BLAST program from the ncbi-blast-suite package version 2.13.0, Python scripts and packages such as pyGenomeViz and Biopython. The phylogenetic tree was constructed using the roary program (v.3.13.0). Full genome alignment was carried out using the nucmer and promer programs from the MUMmer 4 package version 4.0. Results and discussion. R-variant V. cholerae contains different types of wb* clusters in the genome, with most commonly occurring O23 and O59. A comparison has been made between translated amino acid sequences of wb* regions in R-variant strains and amino acid sequences of reference strains present in the NCBI database. Some of the analyzed clusters completely match with reference strains, while others show high variability. Phylogenetically, the strains primarily group together according to the wb* cluster type, regardless of the S/R phenotype. Classifying R-variant V. cholerae strains based on agglutinability is challenging. Molecular research methods, polymerase chain reaction, in particular, are necessary to determine the pathogenic potential of such strains.

Vibrio choleraeR-вариантwb* кластерсерогруппаwbeVibrio choleraeR-variantwb* clusterserogroupwbeReferencesЛевченко Д.А., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Якушева О.А., Алексеева Л.П., Водопьянов С.О., Ежова М.И., Носков А.К. Изучение диапазона изменчивости по агглютинабельности штаммов Vibrio cholerae, выделенных при мониторинговых исследованиях. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:107–14. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-107-114.Levchenko D.A., Kruglikov V.D., Arkhangel’skaya I.V., Yakusheva O.A., Alekseeva L.P., Vodop’yanov S.O., Ezhova M.I., Noskov A.K. [Assessment of the variation range of agglutinability in Vibrio cholerae strains isolated in the course of monitoring studies]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; (3):107–14. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-107-114.Chatterjee S.N., Chaudhuri K. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae. I. Physical and chemical characterization. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1639(2):65–79. DOI: 10.1016/j.bbadis.2003.08.004.Chatterjee S.N., Chaudhuri K. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae. I. Physical and chemical characterization. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1639(2):65–79. DOI: 10.1016/j.bbadis.2003.08.004.Blokesch M., Schoolnik G.K. Serogroup conversion of Vibrio cholerae in aquatic reservoirs. PLoS Pathog. 2007; 3(6):e81. DOI: 10.1371/journal.ppat.0030081.Blokesch M., Schoolnik G.K. Serogroup conversion of Vibrio cholerae in aquatic reservoirs. PLoS Pathog. 2007; 3(6):e81. DOI: 10.1371/journal.ppat.0030081.Aydanian A., Tang L., Morris J.G., Johnson J.A., Stine O.C. Genetic diversity of O-antigen biosynthesis regions in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(7):2247–53. DOI: 10.1128/AEM.01663-10.Aydanian A., Tang L., Morris J.G., Johnson J.A., Stine O.C. Genetic diversity of O-antigen biosynthesis regions in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(7):2247–53. DOI: 10.1128/AEM.01663-10.Xu J., Zhang J., Lu X., Liang W., Zhang L., Kan B. O antigen is the receptor of Vibrio cholerae serogroup O1 El Tor typing phage VP4. J. Bacteriol. 2013; 195(4):798–806. DOI: 10.1128/JB.01770-12.Xu J., Zhang J., Lu X., Liang W., Zhang L., Kan B. O antigen is the receptor of Vibrio cholerae serogroup O1 El Tor typing phage VP4. J. Bacteriol. 2013; 195(4):798–806. DOI: 10.1128/ JB.01770-12.Li M., Shimada T., Morris J.G. Jr, Sulakvelidze A., Sozhamannan S. Evidence for the emergence of non-O1 and non-O139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions. Infect. Immun. 2002; 70(5):2441–53. DOI: 10.1128/IAI.70.5.2441-2453.2002.Li M., Shimada T., Morris J.G. Jr, Sulakvelidze A., Sozhamannan S. Evidence for the emergence of non-O1 and non-O139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions. Infect. Immun. 2002; 70(5):2441–53. DOI: 10.1128/IAI.70.5.2441-2453.2002.De K., Ramamurthy T., Faruque S.M., Yamasaki S., Takeda Y., Nair G.B., Nandy R.K. Molecular characterisation of rough strains of Vibrio cholerae isolated from diarrhoeal cases in India and their comparison to smooth strains. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 232(1):23–30. DOI: 10.1016/S0378-1097(04)00013-8.De K., Ramamurthy T., Faruque S.M., Yamasaki S., Takeda Y., Nair G.B., Nandy R.K. Molecular characterisation of rough strains of Vibrio cholerae isolated from diarrhoeal cases in India and their comparison to smooth strains. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 232(1):23–30. DOI: 10.1016/S0378-1097(04)00013-8.Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей атипичных R-форм холерного вибриона на основе моноклональных антител. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998; (4):9–12.Alekseeva L.P., Cherepakhina I.Ya., Sal’nikova O.I., Burlakova O.S. [A monoclonal antibody-based study of the antigenic interrelations of typical and R forms of Vibrio cholerae]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 1998; (4):9–12.Mitra R.K., Nandy R.K., Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., Yamasaki S., Shimada T., Takeda Y., Nair G.B. Molecular characterisation of rough variants of Vibrio cholerae isolated from hospitalised patients with diarrhoea. J. Med. Microbiol. 2001; 50(3):268–76. DOI: 10.1099/0022-1317-50-3-268.Mitra R.K., Nandy R.K., Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., Yamasaki S., Shimada T., Takeda Y., Nair G.B. Molecular characterisation of rough variants of Vibrio cholerae isolated from hospitalised patients with diarrhoea. J. Med. Microbiol. 2001; 50(3):268–76. DOI: 10.1099/0022-1317-50-3-268.Заднова С.П., Смирнова Н.И. Роль внеклеточного экзополисахарида в адаптации возбудителя холеры во внешней среде. Проблемы особо опасных инфекций. 2010; 3:13–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2010-3(105)-13-19.Zadnova S.P., Smirnova N.I. [The Role of Extracellular exopolysaccharide in cholera agent adaptation in the environment]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2010; (3):13–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2010-3(105)-13-19.Shimada T., Sakazaki R. R antigen of Vibrio cholerae. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1973; 26(4):155–60. DOI: 10.7883/yoken1952.26.155.Shimada T., Sakazaki R. R antigen of Vibrio cholerae. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1973; 26(4):155–60. DOI: 10.7883/yoken1952.26.155.Yang X., Liu D., Liu F., Wu J., Zou J., Xiao X., Zhao F., Zhu B. HTQC: a fast quality control toolkit for Illumina sequencing data. BMC Bioinformatics. 2013; 14:33. DOI: 10.1186/1471-2105-14-33.Yang X., Liu D., Liu F., Wu J., Zou J., Xiao X., Zhao F., Zhu B. HTQC: a fast quality control toolkit for Illumina sequencing data. BMC Bioinformatics. 2013; 14:33. DOI: 10.1186/1471-2105-14-33.Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15):2114–20. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu170.Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15):2114–20. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu170.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Gurevich А., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8):1072–5. DOI: 10.1093/bioinformatics/btt086.Gurevich А., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8):1072–5. DOI: 10.1093/bioinformatics/btt086.Slater G.S., Birney E. Automated generation of heuristics for biological sequence comparison. BMC Bioinformatics. 2005; 6:31. DOI: 10.1186/1471-2105-6-31.Slater G.S., Birney E. Automated generation of heuristics for biological sequence comparison. BMC Bioinformatics. 2005; 6:31. DOI: 10.1186/1471-2105-6-31.Zhang Z., Schwartz S., Wagner L., Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J. Comput. Biol. 2000; 7(1-2): 203–14. DOI: 10.1089/10665270050081478.Zhang Z., Schwartz S., Wagner L., Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J. Comput. Biol. 2000; 7(1-2): 203–14. DOI: 10.1089/10665270050081478.Page A.J., Cummins C.A., Hunt M., Wong V.K., Reuter S., Holden M.T., Fookes M., Falush D., Keane J.A., Parkhill J. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics. 2015; 31(22):3691–3. DOI: 10.1093/bioinformatics/btv421.Page A.J., Cummins C.A., Hunt M., Wong V.K., Reuter S., Holden M.T., Fookes M., Falush D., Keane J.A., Parkhill J. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics. 2015; 31(22):3691–3. DOI: 10.1093/bioinformatics/btv421.Marçais G., Delcher A.L., Phillippy A.M., Coston R., Salzberg S.L., Zimin A. MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system. PLoS Comput. Biol. 2018; 14(1):e1005944. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1005944.Marçais G., Delcher A.L., Phillippy A.M., Coston R., Salzberg S.L., Zimin A. MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system. PLoS Comput. Biol. 2018; 14(1):e1005944. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1005944.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.