microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2025-4-156-162microbe-2262Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESАвирулентный пробиотический штамм Escherichia coli, продуцирующий B-субъединицу холерного токсина: получение, стабильность наследования и экспрессия клонированного гена ctxBAvirulent Probiotic Strain of Escherichia coli, Producing the B-Subunit of Cholera Toxin: Obtainment, Stability of Inheritance, and Expression of the Cloned ctxB Genehttps://orcid.org/0000-0003-3896-7762ЧеховскаяГ. В.ChekhovskayaG. V.

Чеховская Галина Викторовна, 

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

Galina V. Chekhovskaya, 

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0009-0003-7100-9088КрепостноваИ. М.KrepostnovaI. M.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3117-8229РыбальченкоД. А.Rybal’chenkoD. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0009-0001-7163-206XЩелкановаЕ. Ю.ShchelkanovaE. Yu.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7115-6286СмирноваН. И.SmirnovaN. I.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation20251401202604156162Copyright © Чеховская Г.В., Крепостнова И.М., Рыбальченко Д.А., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И., 20262026Чеховская Г.В., Крепостнова И.М., Рыбальченко Д.А., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И.Chekhovskaya G.V., Krepostnova I.M., Rybal’chenko D.A., Shchelkanova E.Y., Smirnova N.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2262

Цель исследования – получение продуцента B-субъединицы холерного токсина на основе авирулентного пробиотического штамма Escherichia coli M-17, изучение его молекулярно-генетических и иммуногенных свойств.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использовали генетически маркированный штамм E. coli KS164 thy polA (pIEM3), содержащий рекомбинантную плазмиду с клонированным геном ctxB, кодирующим B-субъединицу холерного токсина, и авирулентный штамм Е. coli M-17, применяемый для производства колисодержащих пробиотиков. Анализ штаммов проводили различными методами: молекулярно-генетическими, биохимическими и иммунологическими.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. При введении методом конъюгации в клетки штамма Е. coli M-17 рекомбинантной коинтегратной плазмиды pIEM3(KmRTcR) с клонированным геном ctxB получены трансконъюганты KmRTcR с высоким уровнем продукции секретируемой B-субъединицы холерного токсина (10 мкг/мл), один из которых (КМ147) взят в качестве штамма-продуцента этого протективного антигена. Показано, что сконструированный штамм Е. coli KM147(pIEM3) KmRTcR стабильно наследует клонированный ген ctxB в составе рекомбинантной плазмиды, способен к образованию антитоксических антител у иммунизированных животных и безопасен для модельных животных. Совокупность этих свойств определяет перспективность его дальнейшего использования при конструировании профилактических и диагностических холерных препаратов.

The aim of the study was to obtain a cholera toxin B-subunit producer based on the avirulent probiotic strain Escherichia coli M-17 and to study its molecular-genetic and immunogenic properties.

Materials and methods

Materials and methods. The genetically marked E. coli KS164 thy polA (pIEM3) strain, containing a recombinant plasmid with the cloned ctxB gene encoding the B-subunit of cholera toxin, and the avirulent E. coli M-17 strain, applied for the production of colicontaining probiotics, were used. The strains were analyzed using various methods: molecular genetics, biochemistry, and immunology.

Results and discussion

Results and discussion. Through introducing the recombinant cointegrate plasmid pIEM3 (KmRTcR) with the cloned ctxB gene into E. coli M-17 cells via conjugation, KmRTcR transconjugants with high levels of secreted cholera toxin B-subunit production (10 μg/ml) were obtained. One of these transconjugants (KM147) was used as the producer strain for the protective antigen. It was demonstrated that the constructed E. coli strain KM147(pIEM3) KmRTcR stably inherits the cloned ctxB gene contained in the recombinant plasmid, is capable of producing antitoxic antibodies in immunized animals, and safe for the use in model animals. These properties combined make it promising for future use in the development of prophylactic and diagnostic cholera drugs.

Escherichia coliрекомбинантная плазмидаклонированный ген В-субъединицы холерного токсинаавирулентностьиммуногенностьEscherichia colirecombinant plasmidcloned cholera toxin B-subunit geneavirulenceimmunogenicityReferencesFinkelstein R.A., LoSpalluto J.J. Pathogenesis of experimental cholera. Preparation and isolation of choleragen and chole¬ ragenoid. J. Exp. Med. 1969; 130(1):185–202. DOI: 10.1084/ jem.130.1.185.Finkelstein R.A., LoSpalluto J.J. Pathogenesis of experimental cholera. Preparation and isolation of choleragen and chole¬ ragenoid. J. Exp. Med. 1969; 130(1):185–202. DOI: 10.1084/jem.130.1.185.Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol. Rev. 1996; 60(1):167–215. DOI: 10.1128/mr.60.1.167-215.1996.Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol. Rev. 1996; 60(1):167–215. DOI: 10.1128/mr.60.1.167-215.1996.Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a flamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996; 272(5270):1910–4. DOI: 10.1126/science.272.5270.1910.Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a flamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996; 272(5270):1910–4. DOI: 10.1126/science.272.5270.1910.DOI: 10.1126/science.272.5270.1910. 4. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л., Шагинян И.А., Вертиев Ю.В., Смирнов Г.Б. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1984; (9):12–8.Gintsburg A.L., Yanishevsky N.V., MotinV.L., Shaginyan I.A., Vertiev Yu.V., Smirnov G.B. [Arrangement and cloning of Vibrio cholerae El Tor RV79 structure genes of enterotoxin]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 1984; (9):12–8.Янишевский Н.В., Гинцбург А.Л., Вертиев Ю.В., Демме Ю.М., Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987; (4):26–32.Yanishevsky N.V., Gintsburg A.L., Vertiev Yu.V., Demme Yu.M., Karataev G.I., Smirnov G.B. [Construction of recombinant plasmids encoding the biosynthesis of the beta-subunit of cholera toxin]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 1987; (4):26–32.Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIEM3, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae – продуцент В-субъединицы холерного токсина. Авторское свидетельство № 1505022 СССР, опубл. 15.10.1991. Бюл. № 38.Il’ina T.S., Smirnov G.B., Smirnova N.I., Livanova L.F. [pI-EM3 recombinant plasmid DNA encoding the synthesis of the chole¬ ra toxin B subunit, the method of its construction, and the bacterial strain Vibrio cholerae, a producer of the cholera toxin B subunit]. SU Patent No. 1505022, publ. 15.10.1991. Bull. No. 38.Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М.: Медгиз; 1955. 436 с.Peretts L.G. [The Importance of Normal Microflora for the Human Body]. Moscow: “Medgiz”; 1955. 436 p.Белова И.В., Точилина А.Г., Соловьева И.В., Ефимов Е.И., Горлова И.С., Иванова Т.П., Жирнов В.А. Результаты генетического анализа пробиотического штамма Escheriсhia coli M-17 и потенциально пробиотического штамма Escheriсhia coli ВМ. Микробиология. 2019; 88(3):328–35. DOI: 10.1134/ S0026365619030030.Belova I.V., Tochilina A.G., Solov’eva I.V., Efimov E.I., Gorlova I.S., Ivanova T.P., Zhirnov V.A. [Genetic analysis of the probiotic strain Escheriсhia coli M-17 and the potentially probiotic strain Escheriсhia coli ВМ]. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2019; 88(3):328–35. DOI: 10.1134/S0026365619030030.Смирнова Н.И., Крепостнова И.М., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Еремин С.А., Ильина Т.С. Авирулентный штамм Vibrio cholerae – продуцент B-субъединицы холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2007; (4):7–13.Smirnova N.I., Krepostnova I.M., Livanova L.F., Zadnova S.P., Eremin S.A., Il’ina T.S. [Avirulent Vibrio cholerae strain – producer of cholera toxin B-subunit: engineering and molecular-genetic analysis]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2007; (4):7–13.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitali¬ zed patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitali¬ zed patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.Hu D., Liu B., Feng L., Ding P., Guo X., Wang M., Cao B., Reeves P.R., Wang L. Origins of the current seventh cholera pande¬mic. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113(48):E7730-Е7739. DOI: 10.1073/pnas.1608732113.Hu D., Liu B., Feng L., Ding P., Guo X., Wang M., Cao B., Reeves P.R., Wang L. Origins of the current seventh cholera pande¬mic. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113(48):E7730-Е7739. DOI: 10.1073/pnas.1608732113.Смирнова Н.И., Баданин Д.В., Рыбальченко Д.А., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Федоров А.В., Кутырев В.В. Изменчивость генома холерных вибрионов Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021; 39(2):25–37. DOI: 10.17116/molgen20213902125.Smirnova N.I., Badanin D.V., Rybal’chenko D.A., Krasnov Ya.M., Kritskii A.A., Lozovskii Ya.V., Fedorov A.V., Kutyrev V.V. [Variability of the genome of El Tor cholera vibrios isolated before the onset and in different periods of the current pandemic]. Molekulyarnaya Genetika, Mikroabiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2021; 39(2):25– 37. DOI: 10.17116/molgen20213902125.Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B., Uhlén M., Popovic T., Wachsmuth I.K., Fields P.I. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1):22–5. DOI: 10.1128/jcm.31.1.22-25.1993.Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B., Uhlén M., Popovic T., Wachsmuth I.K., Fields P.I. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1):22–5. DOI: 10.1128/jcm.31.1.22-25.1993.Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae. J. Gen. Microbiol. 1956; 15(2):417–22. DOI: 10.1099/00221287-15-2-417.Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae. J. Gen. Microbiol. 1956; 15(2):417–22. DOI: 10.1099/00221287-15-2-417.Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M., Charunmethee P. Pathogenesis of experimental cholera: biologic activities of purified procholeragen A. J. Immunol. 1966; 96(3):440–9.Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M., Charunmethee P. Pathogenesis of experimental cholera: biologic activities of purified procholeragen A. J. Immunol. 1966; 96(3):440–9.Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1980; 143(3):1466–70. DOI: 10.1128/jb.143.3.1466-1470.1980.Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1980; 143(3):1466–70. DOI: 10.1128/jb.143.3.1466-1470.1980.Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365–73. DOI: 10.1128/jb.145.3.1365-1373.1981.Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365–73. DOI: 10.1128/jb.145.3.1365-1373.1981.Siddique A.K., Zaman K., Akram K., Mutsuddy P., Eusof A., Sack R.B. Emergence of a new epidemic strain of Vibrio cholerae in Bangladesh. An epidemiological study. Trop. Geogr. Med. 1994; 46(3):147–50.Siddique A.K., Zaman K., Akram K., Mutsuddy P., Eusof A., Sack R.B. Emergence of a new epidemic strain of Vibrio cholerae in Bangladesh. An epidemiological study. Trop. Geogr. Med. 1994; 46(3):147–50.Bramucei M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat-labile enterotoxin produced by individual colonies of Escherichia coli or Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 1978; 8(2):252–5. DOI: 10.1128/jcm.8.2.252-255.1978.Bramucei M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat-labile enterotoxin produced by individual colonies of Escherichia coli or Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 1978; 8(2):252–5. DOI: 10.1128/jcm.8.2.252-255.1978.Шагинян И.А., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки. Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1983; (2):92–6.Шагинян И.А., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки. Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1983; (2):92–6.Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1978; 1:19–23. DOI: 10.1007/BF02601701.Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1978; 1:19–23. DOI: 10.1007/BF02601701.Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation. Br. J. Pharmacol. Chemother. 1955; 10(2):153–9. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1955.tb00074.x.Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation. Br. J. Pharmacol. Chemother. 1955; 10(2):153–9. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1955.tb00074.x.Cray W.C. Jr, Tokunaga E., Pierce N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 1983; 41(2):735–41. DOI: 10.1128/iai.41.2.735-741.1983.Cray W.C. Jr, Tokunaga E., Pierce N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 1983; 41(2):735–41. DOI: 10.1128/iai.41.2.735-741.1983.Pearson G.D., Mekalanos J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1982; 79(9):2976–80. DOI: 10.1073/pnas.79.9.2976.Pearson G.D., Mekalanos J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1982; 79(9):2976–80. DOI: 10.1073/pnas.79.9.2976.Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М. Штамм бактерий Escherichia coli КМ 147 – продуцент В-субъединицы холерного токсина. Патент РФ № 2238975, опубл. 27.10.2004. Бюл. № 30.Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М. Штамм бактерий Escherichia coli КМ 147 – продуцент В-субъединицы холерного токсина. Патент РФ № 2238975, опубл. 27.10.2004. Бюл. № 30.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.