microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2026-1-90-98microbe-2287Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОптимизация метода мультилокусного сиквенс-типирования генов вирулентности (MVLST) Bacillus anthracisOptimization of the Multilocus Sequence Typing Method for Virulence Genes of Bacillus anthracis (MVLST)https://orcid.org/0000-0002-1117-1185ЕременкоЕ. И.EremenkoE. I.

Еременко Евгений Иванович

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

Evgeny I. Eremenko

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

anthraxlab.stv@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0006-4544-7860НикитинаА. В.NikitinaA. V.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

https://orcid.org/0000-0002-5196-784XРязановаА. Г.RyazanovaA. G.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

https://orcid.org/0000-0001-7033-9972ПечковскийГ. А.PechkovskyG. A.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13–15

13–15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институтРоссияStavropol Research Anti-Plague InstituteRussian Federation202630032026019098Copyright © Еременко Е.И., Никитина А.В., Рязанова А.Г., Печковский Г.А., 20262026Еременко Е.И., Никитина А.В., Рязанова А.Г., Печковский Г.А.Eremenko E.I., Nikitina A.V., Ryazanova A.G., Pechkovsky G.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2287

В России эпидемическая ситуация по сибирской язве остается нестабильной, несмотря на достигнутые успехи в профилактике и лечении. Независимо от характера вспышки, эпидемиологическое расследование требует установления вероятного происхождения и генетического родства штамма, ее вызвавшего, что достигается при молекулярном типировании. Bacillus anthracis отличается высокой генетической мономорфностью, усложняющей молекулярное типирование. Вариант MLST, метод мультилокусного сиквенс-типирования генов вирулентности (MVLST) позволяет эффективно дифференцировать штаммы возбудителя. Цель работы – выбор оптимальной схемы MVLST для генетического типирования B. anthracis. Материалы и методы. Использовали полные геномы 49 штаммов B. anthracis. Для построения филограмм с алгоритмом UPGMA выявляли SNP в программе PhyloViz. Вирулентность белков оценивали и отбор кодируемых генов проводили с онлайн-ресурсом «VirulentPred: Prediction of prokariotic virulent protein». Определение индекса дискриминации D Хантера – Гастона проводили онлайн в программе Discriminatory Power Calculator. Результаты и обсуждение. MVLST-pXO1 включала пять генов: lef, cya, pagA, atxA, gerXC, – локализованных на плазмиде токсинообразования pXO1. Типирование по схеме MVLSTpXO1 49 штаммов позволило разделить их на 21 генотип (D=0,9209). Схема MVLST-pXO2 охватывала четыре структурных гена капсульного полипептида: capA, capB, capC, capD – и два регуляторных гена: acpA, acpB – плазмиды капсулообразования pXO2. Типирование по схеме MVLST-pXO2 разделило 49 штаммов на 14 генотипов (D=0,6675). Полученная схема MVLST-15 по сравнению с MVLST-19 обеспечивала более высокую дискриминирующую силу, так как разделяла 49 штаммов B. anthracis на 40 генотипов (D=0,9864), тогда как показатели MVLST-19 составляли соответственно 33 генотипа (D=0,9633). Результаты показывают, что оптимальной может быть схема MVLST-15, так как обеспечивает лучшую дискриминацию штаммов B. anthracis, используя меньший набор локусов при сохранении классической филогенетической структуры возбудителя сибирской язвы.

In Russia, the epidemic situation on anthrax remains unstable despite achieved progress in its prevention and treatment. Regardless of the nature of the outbreak, epidemiological investigation requires establishing the probable origin and genetic relatedness of the strain responsible, which is attained through molecular typing. Bacillus anthracis is characterized by high genetic monomorphism, complicating molecular typing. The MLST variant, a multilocus sequence typing method for virulence genes (MVLST), allows for effective differentiation of pathogen strains. The aim of this study was to select the optimal MVLST scheme for the genetic typing of B. anthracis. Materials and methods. The study used complete genomes of 49 B. anthracis strains. Phylogenetic trees were constructed using UPGMA algorithm through identifying SNPs with PhyloViz software. Protein virulence assessment and gene selection were performed using the online resource “VirulentPred Prediction of Prokaryotic Virulent Proteins”. The Hunter-Gaston discriminatory index (D) was calculated online using the Discriminatory Power Calculator program. Results and discussion. The MVLST-pXO1 scheme included 5 genes: lef, cya, pagA, atxA, gerXC, located on the pXO1 toxin plasmid. Typing with the MVLST-pXO1 scheme divided 49 strains into 21 genotypes (D=0.9209). The MVLST-pXO2 scheme covered 6 genes: 4 structural genes of capsule polypeptide (capA, capB, capC, capD), and 2 regulatory genes (acpA, acpB) on the pXO2 capsule plasmid. Typing with this scheme distinguished 14 genotypes (D=0.6675) among 49 strains. The derived MVLST-15 scheme provided higher discriminatory power compared to MVLST-19, dividing 49 B. anthracis strains into 40 genotypes (D=0.9864), whereas MVLST-19 identified 33 genotypes (D=0.9633). These results demonstrate that the MVLST-15 scheme is optimal, as it provides better discrimination of B. anthracis strains using a smaller set of loci while maintaining the classical phylogenetic structure of the anthrax pathogen.

Bacillus anthracisсибирская язваMVLSTвирулентностьBacillus anthracisanthraxMVLSTvirulenceАвторы заявляют об отсутствии дополнительного финансирования при проведении данного исследованияThe authors declare no additional financial support for this studyReferencesРязанова А.Г., Еременко Е.И., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Куличенко А.Н. Оценка эпидемиологической и эпизоотологической обстановки по сибирской язве в 2016 г., прогноз на 2017 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (1):21–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-21-23.Ryazanova A.G., Eremenko E.I., Aksenova L.Yu., Semenova O.V., Buravtseva N.P., Golovinskaya T.M., Kulichenko А.N. [Evaluation of epidemiological and epizootiological situation on anthrax in 2016, the forecast for 2017]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; (1):21–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-21-23.Rasko D.A., Worsham P.L., Abshire T.G., Stanley S.T., Bannan J.D., Wilson M.R., Langham R.J., Decker R.S. Jiang L., Read T.D., Phillippy A.M., Salzberg S.L., Pop M., Van Ert M.N., Kenefic L.J., Keim P.S., Fraser-Liggett C.M., Ravel J. Bacillus anthracis comparative genome analysis in support of the Amerithrax investigation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(12):5027–32. DOI: 10.1073/pnas.1016657108.Rasko D.A., Worsham P.L., Abshire T.G., Stanley S.T., Bannan J.D., Wilson M.R., Langham R.J., Decker R.S. Jiang L., Read T.D., Phillippy A.M., Salzberg S.L., Pop M., Van Ert M.N., Kenefic L.J., Keim P.S., Fraser-Liggett C.M., Ravel J. Bacillus anthracis comparative genome analysis in support of the Amerithrax investigation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(12):5027–32. DOI: 10.1073/pnas.1016657108.Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J., Zanecki S.R., Pearson T., Simonson T.S., U’Ren J.M., Kachur S.M., Leadem-Dougherty R.R., Rhoton S.D., Zinser G., Farlow J., Coker P.R., Smith K.L., Wang B., Kenefic L.J., Fraser-Liggett C.M., Wagner D.M., Keim P. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007; 2(5):e461. DOI: 10.1371/journal.pone.0000461.Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J., Zanecki S.R., Pearson T., Simonson T.S., U’Ren J.M., Kachur S.M., Leadem-Dougherty R.R., Rhoton S.D., Zinser G., Farlow J., Coker P.R., Smith K.L., Wang B., Kenefic L.J., Fraser-Liggett C.M., Wagner D.M., Keim P. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007; 2(5):e461. DOI: 10.1371/journal.pone.0000461.Еременко Е.И., Печковский Г.А., Рязанова А.Г., Писаренко Н.В., Ковалев Д.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Куличенко А.Н. Анализ in silico геномов штаммов Bacillus anthracis главных генетических линий. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023; 100(3):155–65. DOI: 10.36233/0372-9311-385.Eremenko E.I., Pechkovsky G.A., Ryazanova A.G., Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Aksenova L.Yu., Semenova O.V., Kulichenko A.N. [In silico analysis of genomes of Bacillus anthracis strains belonging to major genetic lineages]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2023; 100(3):155–65. DOI: 10.36233/0372-9311-385.Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115–25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115–25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.Sirard J.C., Guidi-Rontani C., Fouet A., Mock M. Characterization of a plasmid region involved in Bacillus anthracis toxin production and pathogenesis. Int. J. Med. Microbiol. 2000; 290(4-5):313–6. DOI: 10.1016/S1438-4221(00)80030-2.Sirard J.C., Guidi-Rontani C., Fouet A., Mock M. Characterization of a plasmid region involved in Bacillus anthracis toxin production and pathogenesis. Int. J. Med. Microbiol. 2000; 290(4-5):313–6. DOI: 10.1016/S1438-4221(00)80030-2.Heffernan B.J., Thomason B., Herring-Palmer A., Shaughnessy L., McDonald R., Fisher N., Huffnagle G.B., Hanna P. Bacillus anthracis phospholipases C facilitate macrophage-associated growth and contribute to virulence in a murine model of inhalation anthrax. Infect. Immun. 2006; 74(7):3756–64. DOI: 10.1128/IAI.00307-06.Heffernan B.J., Thomason B., Herring-Palmer A., Shaughnessy L., McDonald R., Fisher N., Huffnagle G.B., Hanna P. Bacillus anthracis phospholipases C facilitate macrophage-associated growth and contribute to virulence in a murine model of inhalation anthrax. Infect. Immun. 2006; 74(7):3756–64. DOI: 10.1128/IAI.00307-06.Shatalin K., Gusarov I., Avetissova E., Shatalina Y., McQuade L.E., Lippard S.J., Nudler E. Bacillus anthracis-derived nitric oxide is essential for pathogen virulence and survival in macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105(3):1009–13. DOI: 10.1073/pnas.0710950105.Shatalin K., Gusarov I., Avetissova E., Shatalina Y., McQuade L.E., Lippard S.J., Nudler E. Bacillus anthracis-derived nitric oxide is essential for pathogen virulence and survival in macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105(3):1009–13. DOI: 10.1073/pnas.0710950105.Samant S., Hsu F.-F., Neyfakh A.A., Lee H. The Bacillus anthracis protein MprF is required for synthesis of lysylphosphatidylglycerols and for resistance to cationic antimicrobial peptides. J. Bacteriol. 2009; 191(4):1311–9. DOI: 10.1128/JB.01345-08.Samant S., Hsu F.-F., Neyfakh A.A., Lee H. The Bacillus anthracis protein MprF is required for synthesis of lysylphosphatidylglycerols and for resistance to cationic antimicrobial peptides. J. Bacteriol. 2009; 191(4):1311–9. DOI: 10.1128/JB.01345-08.Lepore L.S., Roelvink P.R., Granados R.R. Enhancin, the granulosis virus protein that facilitates nucleopolyhedrovirus (NPV) infections, is a metalloprotease. J. Invertebr. Pathol. 1996; 68(2):131–40. DOI: 10.1006/jipa.1996.0070.Lepore L.S., Roelvink P.R., Granados R.R. Enhancin, the granulosis virus protein that facilitates nucleopolyhedrovirus (NPV) infections, is a metalloprotease. J. Invertebr. Pathol. 1996; 68(2):131–40. DOI: 10.1006/jipa.1996.0070.Read T.D., Peterson S.N., Tourasse N., Baillie L.W., Paulsen I.T., Nelson K.E., Tettelin H., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Holtzapple E.K., Okstad O.A., Helgason E., Rilstone J., Wu M., Kolonay J.F., Beanan M.J., Dodson R.J., Brinkac L.M., Gwinn M., DeBoy R.T., Madpu R., Daugherty S.C., Durkin A.S., Haft D.H., Nelson W.C., Peterson J.D., Pop M., Khouri H.M., Radune D., Benton J.L., Mahamoud Y., Jiang L., Hance I.R., Weidman J.F., Berry K.J., Plaut R.D., Wolf A.M., Watkins K.L., Nierman W.C., Hazen A., Cline R., Redmond C., Thwaite J.E., White O., Salzberg S.L., Thomason B., Friedlander A.M., Koehler T.M., Hanna P.C., Kolstø A.-B., Fraser C.M. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature. 2003; 423(6935):81–6. DOI: 10.1038/nature01586.Read T.D., Peterson S.N., Tourasse N., Baillie L.W., Paulsen I.T., Nelson K.E., Tettelin H., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Holtzapple E.K., Okstad O.A., Helgason E., Rilstone J., Wu M., Kolonay J.F., Beanan M.J., Dodson R.J., Brinkac L.M., Gwinn M., DeBoy R.T., Madpu R., Daugherty S.C., Durkin A.S., Haft D.H., Nelson W.C., Peterson J.D., Pop M., Khouri H.M., Radune D., Benton J.L., Mahamoud Y., Jiang L., Hance I.R., Weidman J.F., Berry K.J., Plaut R.D., Wolf A.M., Watkins K.L., Nierman W.C., Hazen A., Cline R., Redmond C., Thwaite J.E., White O., Salzberg S.L., Thomason B., Friedlander A.M., Koehler T.M., Hanna P.C., Kolstø A.-B., Fraser C.M. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature. 2003; 423(6935):81–6. DOI: 10.1038/nature01586.Jones M.B., Blaser M.J. Detection of a luxS-signaling molecule in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 2003; 71(7):3914–9. DOI: 10.1128/IAI.71.7.3914-3919.2003.Jones M.B., Blaser M.J. Detection of a luxS-signaling molecule in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 2003; 71(7):3914–9. DOI: 10.1128/IAI.71.7.3914-3919.2003.Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. Characterization of Anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 2003; 71(6):3183–9. DOI: 10.1128/IAI.71.6.3183-3189.2003.Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. Characterization of Anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 2003; 71(6):3183–9. DOI: 10.1128/IAI.71.6.3183-3189.2003.Tran S.-L., Guillemet E., Gohar M., Lereclus D., Ramarao N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation, and virulence. J. Bacteriol. 2010; 192(10):2638–42. DOI: 10.1128/JB.01315-09.Tran S.-L., Guillemet E., Gohar M., Lereclus D., Ramarao N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation, and virulence. J. Bacteriol. 2010; 192(10):2638–42. DOI: 10.1128/JB.01315-09.Xie G., Keyhani N.O., Bonner C.A., Jensen R.A. Ancient origin of the tryptophan operon and the dynamics of evolutionary change. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003; 67(3):303–42. DOI: 10.1128/MBR.67.3.303-342.2003.Xie G., Keyhani N.O., Bonner C.A., Jensen R.A. Ancient origin of the tryptophan operon and the dynamics of evolutionary change. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003; 67(3):303–42. DOI: 10.1128/MBR.67.3.303-342.2003.Еременко Е.И. Система приобретения связанного с гемом железа у Вacillus аnthracis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(1):3–7. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-1-3-7.Eremenko E.I. [System of acquisition of heme-bound iron in Bacillus anthracis]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2017; 35(1):3–7. DOI: 10.18821/0208-0613-2017-35-1-3-7.Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Писаренко С.В., Варфоломеева Н.Г., Жиров А.М., Волынкина А.С., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Котенева Е.А., Цыганкова О.И., Дятлов И.А., Тимофеев В.С., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Кисличкина А.А., Миронова Р.И., Титарева Г.М., Скрябин Ю.П., Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Колбасов Д.В. Биологические свойства и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (1):94–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99.Kulichenko A.N., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Aksenova L.Yu., Kovalev D.A., Pisarenko S.V., Varfolomeeva N.G., Zhirov A.M., Volynkina А.S., Buravtseva N.P., Golovinskaya T.M., Koteneva E.A., Tsygankova O.I., Dyatlov I.A., Timofeev V.S., Bogun A.G., Bakhteeva I.V., Kislichkina A.A., Mironova R.I., Titareva G.M., Skryabin Yu.P., Selyaninov Yu.O., Egorova I.Yu., Kolbasov D.V. [Biological properties and molecular-genetic characteristics of Bacillus anthracis strains, isolated during the outbreak of anthrax in the Yamalo-Nenets Autonomous District in 2016]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; (1):94–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99.Гончарова Ю.О., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Миронова Р.И., Кравченко Т.Б., Остарков Н.А., Брушков А.В., Тимофеев В.С., Игнатов С.Г. Аллельный полиморфизм генов факторов патогенности возбудителя сибирской язвы как метод оценки микробиологических рисков при изменении климата. Прикладная биохимия и микробиология. 2022; 58(4):338–51. DOI: 10.31857/S0555109922040055.Goncharova Yu.O., Bogun A.G., Bakhtaeva I.V., Titareva G.M., Mironova R.I., Kravchenko T.V., Ostarkov N.A., Brushkov A.V., Timofeev V.S., Ignatov S.G. [Allelic polymorphism of virulence factor genes of the anthrax pathogen as a method for assessing microbiological risks in climate change]. Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2022; 58(4):338–51. DOI: 10.31857/S0555109922040055.Гончарова Ю.О., Хлопова К.В., Евсеева В.В., Кравченко Т.Б., Миронова Р.И., Бахтеева И.В., Соломенцев В.И., Скрябин Ю.П., Тимофеев В.С. MVLST-анализ штаммов Bacillus anthracis эволюционной линии B. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2024; 42(3):12–21. DOI: 10.17116/molgen20244203112.Goncharova Yu.O., Khlopova K.V., Evseeva V.V., Kravchenko T.B., Mironova R.I., Bakhteeva I.V., Solomentsev V.I., Skryabin Yu.P., Timofeev V.S. [MVLST-analysis of Bacillus anthracis strains of the evolutionary lineage B]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2024; 42(3):12–21. DOI: 10.17116/molgen20244203112.Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Хлопова К.В., Тимофеев В.С. Мультилокусное сиквенстипирование штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории России и сопредельных государств. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; (1):95–102. DOI: 10.21055/03701069-2021-1-95-102.Goncharova Yu.O., Bakhteeva I.V., Mironova R.I., Bogun A.G., Khlopova K.V., Timofeev V.S. [Multilocus sequence typing of anthrax strains isolated in Russia and neighboring countries]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; (1):95–102. DOI: 10.21055/0370-10692021-1-95-102.Garg A., Gupta D. VirulentPred: a SVM based prediction method for virulent proteins in bacterial pathogens. BMC Bioinformatics. 2008; 9:62. DOI: 10.1186/1471-2105-9-62.Garg A., Gupta D. VirulentPred: a SVM based prediction method for virulent proteins in bacterial pathogens. BMC Bioinformatics. 2008; 9:62. DOI: 10.1186/1471-2105-9-62.Hunter P.R. Reproducibility and indices of discriminatory power of microbial typing methods. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(9):1903–5. DOI: 10.1128/jcm.28.9.1903-1905.1990.Hunter P.R. Reproducibility and indices of discriminatory power of microbial typing methods. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(9):1903–5. DOI: 10.1128/jcm.28.9.1903-1905.1990.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.