microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2026-1-116-122microbe-2290Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESГенотипирование штаммов Francisella tularensis subsp. Mediasiatica с использованием маркерных SNPGenotyping of Francisella tularensis subsp. mediasiatica Strains Using Marker SNPshttps://orcid.org/0000-0001-6926-0239КовалевичА. А.KovalevichA. A.

Ковалевич Алексей Александрович

344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

Alexey A. Kovalevich

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-onDon, 344002

kovalevich_aa@antiplague.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7178-8021ПисановР. В.PisanovR. V.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-onDon, 344002

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9056-3231ВодопьяновА. С.Vodop’yanovA. S.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-onDon, 344002

plague@aaanet.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1835-1496СорокинВ. М.SorokinV. M.

344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40

117/40, M. Gor’kogo St., Rostov-onDon, 344002

plague@aaanet.ruРостовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институтРоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian Federation20263003202601116122Copyright © Ковалевич А.А., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Сорокин В.М., 20262026Ковалевич А.А., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Сорокин В.М.Kovalevich A.A., Pisanov R.V., Vodop’yanov A.S., Sorokin V.M.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2290

Цель исследования – генотипирование штаммов Francisella tularensis subsp. mediasiatica с использованием маркерных SNP на основе данных полногеномного секвенирования. Материалы и методы. В работе использовали 50 полных геномов (WGS) штаммов F. tularensis subsp. mediasiatica из базы данных NCBI и 25 геномов, секвенирование которых проведено специалистами ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Выделение отдельных кластеров на дендрограмме проводили при значении бутстреп-поддержки как минимум >90 % (при использовании 1000 репликаций). Результаты и обсуждение. На репрезентативной выборке из 75 геномов F. tularensis subsp. mediasiatica были отобраны 5251 SNP, встречающиеся минимум у двух штаммов. В ходе биоинформационного анализа исключены геномы с более чем 500 SNP в участках, не охваченных WGS. На основе филогенетического анализа построена дендрограмма и выделены 11 крупных кластеров, названных по географическим локациям ранних или доминирующих штаммов, при бутстреп-поддержке >90 % (1000 репликаций). Для типирования штаммов в кластерах определены «маркерные» SNP, характерные для каждого кластера и его дочерних групп, но отсутствующие у остальных. Разработана программа «SNP Genotyper» для автоматического определения генотипа штаммов на основе маркерных SNP. Проведено изучение генетической вариабельности F. tularensis subsp. mediasiatica различного происхождения методом анализа wgSNP. Выявлено генетическое разнообразие штаммов subsp. mediasiatica, выделенных на территориях Алтайского края (Российская Федерация) и Республики Казахстан. На основе маркерных SNP разработан алгоритм для оперативного анализа WGS-данных геномов F. tularensis subsp. mediasiatica. Разработанная методика определения генетических линий может стать полезным инструментом как для оперативного анализа при выделении свежих штаммов, определения филогенетического родства штаммов, изучения генетического разнообразия популяции, так и при проведении ретроспективных исследований.

The aim of the study was the genotyping of Francisella tularensis subsp. mediasiatica strains using marker SNPs based on whole genome sequencing data. Materials and methods. The work used 50 complete genomes (WGS) of F. tularensis subsp. mediasiatica strains from the NCBI database and 25 genomes, which were sequenced directly by specialists from the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Rospotrebnadzor. The allocation of individual clusters on the dendrogram was carried out with a bootstrap support value of at least >90 % (when using 1000 replications). Results and discussion. A total of 5,251 SNPs identified in a representative sample of 75 F. tularensis subsp. mediasiatica genomes were selected, with each SNP detected in at least two strains. During the bioinformatics analysis, genomes with more than 500 SNPs in regions not covered by whole-genome sequencing (WGS) were excluded. Phylogenetic analysis resulted in a dendrogram that identified 11 major clusters named after the geographic locations of early or dominant strains. These clusters were supported by bootstrap values >90 % (1,000 replicates). For strain typing within the clusters, “marker” SNPs specific to each cluster and its subgroups – but absent in others – were identified. A software tool, “SNP Genotyper”, was developed to automate genotype determination based on those marker SNPs. Genetic variability of F. tularensis subsp. mediasiatica isolates of diverse origins was studied using whole-genome SNP (wgSNP) analysis. Genetic diversity was observed among subsp. mediasiatica strains isolated in Altai Territory (Russian Federation) and the Republic of Kazakhstan. Based on marker SNPs, an algorithm has been developed for the operational analysis of WGS data from F. tularensis subsp. mediasiatica genomes. The developed method for determining genetic lineages can be a useful tool both for operational analysis when isolating fresh strains, determining the phylogenetic relationships of strains, studying the genetic diversity of a population, and conducting retrospective studies.

Francisella tularensis subsp. mediasiaticaгенотипированиеwgSNPмаркерные SNPFrancisella tularensis subsp. mediasiaticagenotypingwgSNPmarker SNPsАвторы заявляют об отсутствии дополнительного финансирования при проведении данного исследования. Авторы выражают благодарность Е.Н. Рождественскому, Г.Х. Базаровой, П.П. Санарову, а также М.В. Цимбалистовой за помощь в проведении исследованияThe authors declare no additional financial support for this study. The authors are grateful to E.N. Rozhdestvensky, G.Kh. Bazarova, P.P. Sanarov, and M.V. Tsimbalistova for assistance in conducting this studyReferencesGürcan Ş. Epidemiology of tularemia. Balkan Med. J. 2014; 31(3):3–10. DOI: 10.5152/balkanmedj.2014.13117.Gürcan Ş. Epidemiology of tularemia. Balkan Med. J. 2014; 31(3):3–10. DOI: 10.5152/balkanmedj.2014.13117.Kilic S., Birdsell D.N., Karagöz A., Çelebi B., Bakkaloglu Z., Arikan M., Sahl J.W., Mitchell C., Rivera A., Maltinsky S., Keim P., Üstek D., Durmaz R., Wagner D.M. Water as source of Francisella tularensis infection in humans, Turkey. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(12):2213–6. DOI: 10.3201/eid2112.150634.Kilic S., Birdsell D.N., Karagöz A., Çelebi B., Bakkaloglu Z., Arikan M., Sahl J.W., Mitchell C., Rivera A., Maltinsky S., Keim P., Üstek D., Durmaz R., Wagner D.M. Water as source of Francisella tularensis infection in humans, Turkey. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(12):2213–6. DOI: 10.3201/eid2112.150634.Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D., Friedlander A.M., Hauer J., Layton M., Lillibridge S.R., McDade J.E., Osterholm M.T., O’Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(21):2763–73. DOI: 10.1001/jama.285.21.2763.Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D., Friedlander A.M., Hauer J., Layton M., Lillibridge S.R., McDade J.E., Osterholm M.T., O’Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(21):2763–73. DOI: 10.1001/jama.285.21.2763.Degabriel M., Valeva S., Boisset S., Henry T. Pathogenicity and virulence of Francisella tularensis. Virulence. 2023; 14(1):2274638. DOI: 10.1080/21505594.2023.2274638.Degabriel M., Valeva S., Boisset S., Henry T. Pathogenicity and virulence of Francisella tularensis. Virulence. 2023; 14(1):2274638. DOI: 10.1080/21505594.2023.2274638.Keim P., Johansson A., Wagner D.M. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105(1):30–66. DOI: 10.1196/annals.1409.011.Keim P., Johansson A., Wagner D.M. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105(1):30–66. DOI: 10.1196/annals.1409.011.Timofeev V., Bakhteeva I., Titareva G., Kopylov P., Christiany D., Mokrievich A., Vergnaud G. Russian isolates enlarge the known geographic diversity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica. PloS One. 2017; 12(9):e0183714. DOI: 10.1371/journal.pone.0183714.Timofeev V., Bakhteeva I., Titareva G., Kopylov P., Christiany D., Mokrievich A., Vergnaud G. Russian isolates enlarge the known geographic diversity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica. PloS One. 2017; 12(9):e0183714. DOI: 10.1371/journal.pone.0183714.Kudryavtseva T.Yu., Mokrievich A.N. Molecular-genetic bases of differences between tularaemia pathogen subspecies and Francisella tularensis subsp. holarctica strain typing. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2022; 37(1):10–8. DOI: 10.3103/s0891416822010049.Kudryavtseva T.Yu., Mokrievich A.N. Molecular-genetic bases of differences between tularaemia pathogen subspecies and Francisella tularensis subsp. holarctica strain typing. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2022; 37(1):10–8. DOI: 10.3103/s0891416822010049.Aikimbaev M.A. Taxonomy of genus Francisella. Rep. Acad. Sci. Kaz. SSR. Ser. Biol. 1966; 5:42–4.Aikimbaev M.A. Taxonomy of genus Francisella. Rep. Acad. Sci. Kaz. SSR. Ser. Biol. 1966; 5:42–4.Olsufjev N.G., Meshcheryakova I.S. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1983; 33(4):872–4. DOI: 10.1099/00207713-33-4-872.Olsufjev N.G., Meshcheryakova I.S. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1983; 33(4):872–4. DOI: 10.1099/00207713-33-4-872.Timofeev V., Bakhteeva I., Mokrievich A., Vakhrameeva G., Gritskova E., Anisimov Yu., Rozhdestvensky E., Bazarova G., Zhumakaev R., Dyatlov I., Vergnaud G. The first finding of Francisella tularensis subsp. mediasiatica in Krasnoyarsk Territory, Siberia, and an update of the subspecies genetic diversity. Bacteria. 2022; 1(4):242–9. DOI: 10.3390/bacteria1040018.Timofeev V., Bakhteeva I., Mokrievich A., Vakhrameeva G., Gritskova E., Anisimov Yu., Rozhdestvensky E., Bazarova G., Zhumakaev R., Dyatlov I., Vergnaud G. The first finding of Francisella tularensis subsp. mediasiatica in Krasnoyarsk Territory, Siberia, and an update of the subspecies genetic diversity. Bacteria. 2022; 1(4):242–9. DOI: 10.3390/bacteria1040018.Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С., Кудрявцева Т.Ю., Уланова Г.И., Карбышева С.Б., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Губарева Т.И., Павлов В.М., Дятлов И.А. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.Mokrievich A.N., Timofeev V.S., Kudryavtseva T.Yu., Ulanova G.I., Karbysheva S.B., Mironova R.I., Vakhrameeva G.M., Gubareva T.I., Pavlov V.M., Dyatlov I.A. [Isolation of Central Asian subspecies of tularemia agent in the Altai Territory]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.Shevtsov A., Izbanova U., Amirgazin A., Kairzhanova A., Dauletov A., Kiyan V., Vergnaud G. Genetic homogeneity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica strains in Kazakhstan. Pathogens. 2024; 13(7):581. DOI: 10.3390/pathogens13070581.Shevtsov A., Izbanova U., Amirgazin A., Kairzhanova A., Dauletov A., Kiyan V., Vergnaud G. Genetic homogeneity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica strains in Kazakhstan. Pathogens. 2024; 13(7):581. DOI: 10.3390/pathogens13070581.Борзенко М.А., Зарва И.Д., Холин А.В., Куликалова Е.С., Мазепа А.В., Сынгеева А.К., Наумова К.В., Рождественский Е.Н., Базарова Г.Х., Санаров П.П., Полковников Е.С., Иваницкая Ю.Н., Сбитнева С.В., Красильникова Н.Ю., Пащенко И.Г. Современная эпидемиологическая ситуация по туляремии на Алтае. В кн.: Санитарно-эпидемиологическое благополучие населения и защита прав потребителей: региональные аспекты. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Иркутск: ООО «Типография «ИРКУТ»; 2022. С. 223–6.Borzenko M.A., Zarva I.D., Holin A.V., Kulikalova E.S., Mazepa A.V., Syngeeva A.K., Naumova K.V., Rozhdestvensky E.N., Bazarova G.Kh., Sanarov P.P., Polkovnikov E.S., Ivanitskaya Yu.N., Sbitneva S.V., Krasil’nikova N.Yu., Pashhenko I.G. [Current epidemiological situation on tularemia in Altai]. In: [Sanitary and Epidemiological Welfare of the Population and Consumer Rights Protection: Regional Aspects. Proceedings of the All-Russian Scientific and Practical Conference]. Irkutsk: LLC Publishing House “IRKUT”; 2022. P. 223–6.Timofeev V., Titareva G., Bahtejeva I., Kombarova T., Kravchenko T., Mokrievich A., Dyatlov I. The comparative virulence of Francisella tularensis subsp. mediasiatica for vaccinated laboratory animals. Microorganisms. 2020; 8(9):1403. DOI: 10.3390/microorganisms8091403.Timofeev V., Titareva G., Bahtejeva I., Kombarova T., Kravchenko T., Mokrievich A., Dyatlov I. The comparative virulence of Francisella tularensis subsp. mediasiatica for vaccinated laboratory animals. Microorganisms. 2020; 8(9):1403. DOI: 10.3390/microorganisms8091403.Larsson P., Elfsmark D., Svensson K., Wikström P., Forsman M., Brettin T., Johansson A. Molecular evolutionary consequences of niche restriction in Francisella tularensis, a facultative intracellular pathogen. PLoS Pathog. 2009; 5(6:)e1000472. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000472.Larsson P., Elfsmark D., Svensson K., Wikström P., Forsman M., Brettin T., Johansson A. Molecular evolutionary consequences of niche restriction in Francisella tularensis, a facultative intracellular pathogen. PLoS Pathog. 2009; 5(6:)e1000472. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000472.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.Seemann T. Snippy: Fast Bacterial Variant Calling from NGS Reads. GitHub; 2022. [Электронный ресурс]. URL: https://github.com/tseemann/snippy.Seemann T. Snippy: Fast Bacterial Variant Calling from NGS Reads. GitHub; 2022. [Internet]. Available from: https://github.com/tseemann/snippy.Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11. Mol. Boil. Evol. 2021; 38(7):3022–7. DOI: 10.1093/molbev/msab120.Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11. Mol. Boil. Evol. 2021; 38(7):3022–7. DOI: 10.1093/molbev/msab120.Huerta-Cepas J., Serra F., Bork P. ETE 3: reconstruction, analysis, and visualization of phylogenomic data. Mol. Boil. Evol. 2016; 33(6):1635–8. DOI: 10.1093/molbev/msw046.Huerta-Cepas J., Serra F., Bork P. ETE 3: reconstruction, analysis, and visualization of phylogenomic data. Mol. Boil. Evol. 2016; 33(6):1635–8. DOI: 10.1093/molbev/msw046.Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.Di Giallonardo F., Puglia I., Curini V., Cammà C., Mangone I., Calistri P., Cobbin J.C.A., Holmes E.C., Lorusso A. Emergence and spread of SARS-CoV-2 lineages B.1.1.7 and P.1 in Italy. Viruses. 2021; 13(5):794. DOI: 10.3390/v13050794.Di Giallonardo F., Puglia I., Curini V., Cammà C., Mangone I., Calistri P., Cobbin J.C.A., Holmes E.C., Lorusso A. Emergence and spread of SARS-CoV-2 lineages B.1.1.7 and P.1 in Italy. Viruses. 2021; 13(5):794. DOI: 10.3390/v13050794.Алиева Б., Ходжаева Г.А. Основные демографические показатели Республики Каракалпакстан. Экономика и социум. 2024; 6-2(121):843–6.Alieva B., Hodzhaeva G.A. [Main demographic indicators of the Republic of Karakalpakstan]. Ekonomika i Sotsium [Economics and Society]. 2024; 6-2(121):843–6.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.