microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2026-1-152-157microbe-2295Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСоздание и свойства штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ без гена sodCDesign and Properties of the Francisella tularensis Strain 15 NIIEG without the sodC Genehttps://orcid.org/0000-0001-9107-5304ПавловВ. М.PavlovV. M.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-1891-0283ВахрамееваГ. М.VakhrameevaG. M.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-3946-1755ПлатоновМ. Е.PlatonovM. E.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-3675-8780МокриевичА. Н.MokrievichA. N.

Мокриевич Александр Николаевич

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Alexander N. Mokrievich

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

mokrievich@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-1959-1739КомбароваТ. И.KombarovaT. I.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0001-8318-4156МироноваР. И.MironovaR. I.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-3899-4277СотниковаМ. А.SotnikovaM. A.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0002-8378-5389СоломенцевВ. И.SolomentsevV. I.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orghttps://orcid.org/0000-0003-1078-4585ДятловИ. А.DyatlovI. A.

142279, Московская область, г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

24, “Block A” Territory, Obolensk, urban district Serpukhov, Moscow Region, 142279

info@obolensk.orgГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологииРоссияState Scientific Center of Applied Microbiology and BiotechnologyRussian Federation20263003202601152157Copyright © Павлов В.М., Вахрамеева Г.М., Платонов М.Е., Мокриевич А.Н., Комбарова Т.И., Миронова Р.И., Сотникова М.А., Соломенцев В.И., Дятлов И.А., 20262026Павлов В.М., Вахрамеева Г.М., Платонов М.Е., Мокриевич А.Н., Комбарова Т.И., Миронова Р.И., Сотникова М.А., Соломенцев В.И., Дятлов И.А.Pavlov V.M., Vakhrameeva G.M., Platonov M.E., Mokrievich A.N., Kombarova T.I., Mironova R.I., Sotnikova M.A., Solomentsev V.I., Dyatlov I.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2295

Цель исследования – создание и изучение иммуногенных свойств штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ без гена sodC, кодирующего CuZn-зависимую супероксиддисмутазу. Материалы и методы. Делецию гена sodC из хромосомы туляремийного микроба проводили методом аллельного обмена с использованием суицидного плазмидного вектора pGM5. Модифицированный фрагмент хромосомы без структурной части гена sodC создавали объединением ампликонов, синтезированных методом ПЦР с помощью двух пар праймеров. Для переноса плазмид в бактерии Escherichia coli и F. tularensis использовали метод электропорации. Для иммунизации и заражения использовали мышей линии BALB/c. Для оценки реактогенности штаммов для мышей определяли средний вес животных в группах. Результаты и обсуждение. Методом аллельного обмена создан штамм F.  tularensis 15ΔsodC, в хромосоме которого отсутствовал фрагмент размером 545 п.о. со структурной частью гена sodC. Данный штамм не отличался по вирулентности и реактогенности от исходного штамма 15 НИИЭГ, но мыши, иммунизированные делетированным вариантом вакцинного штамма, легче переносили экспериментальную инфекцию, вызванную природным штаммом F. tularensis subsp. mediasiatica А-678. Сделано предположение, что удаление гена sodC может улучшить иммуногенные свойства штамма туляремийного микроба при целенаправленном конструировании перспективного кандидата для создания современной туляремийной вакцины со сниженной реактогенностью.

The aim of the study was to create and study the immunogenic properties of Francisella tularensis strain 15 NIIEG without the sodC gene encoding CuZn-dependent superoxide dismutase. Materials and methods. Deletion of the sodC gene from the chromosome of the tularemia microbe was performed applying the allelic exchange method using the suicide plasmid vector pGM5. The modified chromosome fragment without the structural part of the sodC gene was constructed by combining amplicons synthesized via PCR using two pairs of primers. Electroporation was used to transfer plasmids into Escherichia coli and F. tularensis bacteria. BALB/c mice were used for immunization and infection. To assess the reactogenicity of the strains for mice, the average weight of animals in groups was determined. Results and discussion. The allelic exchange method was used to create the F. tularensis 15ΔsodC strain, in the chromosome of which a 545 bp fragment with the structural part of the sodC gene was missing. This strain did not differ in virulence and reactogenicity from the original strain 15 NIIEG, but mice immunized with the deleted version of the vaccine strain more easily tolerated the experimental infection caused by the natural strain F. tularensis subsp. mediasiatica A-678. It has been suggested that deletion of the sodC gene may improve the immunogenic properties of the tularemia microbe strain in the targeted design of a promising candidate for the creation of a modern tularemia vaccine with reduced reactogenicity.

Francisells tularensisвакцинный штаммген sodCделецияаллельный обменFrancisella tularensisvaccine strainsodC genedeletionallelic exchangeРабота выполнена в рамках отраслевой программы РоспотребнадзораThe study was carried out within the framework of the sectoral program of the Rospotrebnadzor.ReferencesОлсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 192 с.Olsuf’ev N.G. [Taxonomy, Microbiology and Laboratory Diagnosis of the Causative Agent of Tularemia]. Moscow: “Meditsina”; 1975. 192 p.Соколов М.И., редактор. Профилактика инфекций живыми вакцинами. М.: Медгиз; 1960. С. 356.Sokolov M.I., editor. [Prevention of Infections by Live Vaccines]. Moscow: “Medgiz”; 1960. P. 356.Медуницын Н.В. Вакцинология. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Триада-Х; 2010. 512 с.Medunitsyn N.V. [Vaccinology]. 3rd ed., revised and updated. Moscow: “Triada-X”; 2010. 512 p.Larsson P., Oyston P.C.F., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius H.-H., Garcia E., Hälltorp G., Johansson D., Isherwood K.E., Karp P.D., Larsson E., Liu Y., Michell S., Prior J., Prior R., Malfatti S., Sjöstedt A., Svensson K., Thompson N., Vergez L., Wagg J.K., Wren B.W., Lindler L.E., Andersson S.G.E., Forsman M., Titball R.W. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37(2):153–9. DOI: 10.1038/ng1499.Larsson P., Oyston P.C.F., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius H.-H., Garcia E., Hälltorp G., Johansson D., Isherwood K.E., Karp P.D., Larsson E., Liu Y., Michell S., Prior J., Prior R., Malfatti S., Sjöstedt A., Svensson K., Thompson N., Vergez L., Wagg J.K., Wren B.W., Lindler L.E., Andersson S.G.E., Forsman M., Titball R.W. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37(2):153–9. DOI: 10.1038/ng1499.Melillo A.A., Mahawar M., Sellati T.J., Malik M., Metzger D.W., Melendez J.A., Bakshi C.S. Identification of Francisella tularensis live vaccine strain CuZn superoxide dismutase as critical for resistance to extracellularly generated reactive oxygen species. J. Bacteriol. 2009; 191(20):6447–56. DOI: 10.1128/JB.00534-09.Melillo A.A., Mahawar M., Sellati T.J., Malik M., Metzger D.W., Melendez J.A., Bakshi C.S. Identification of Francisella tularensis live vaccine strain CuZn superoxide dismutase as critical for resistance to extracellularly generated reactive oxygen species. J. Bacteriol. 2009; 191(20):6447–56. DOI: 10.1128/JB.00534-09.Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С., Кудрявцева Т.Ю., Уланова Г.И., Карбышева С.Б., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Губарева Т.И., Павлов В.М., Дятлов И.А. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.Mokrievich A.N., Timofeev V.S., Kudryavtseva T.Yu., Ulanova G.I., Karbysheva S.B., Mironova R.I., Vakhrameeva G.M., Gubareva T.I., Pavlov V.M., Dyatlov I.A. [Isolation of Central Asian subspecies of tularemia agent in the Altai Territory]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S.S., Michael M.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17(9):3469–78. DOI: 10.1093/nar/17.9.3469.Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S.S., Michael M.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17(9):3469–78. DOI: 10.1093/nar/17.9.3469.Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Павлов В.М. Получение и свойства вакцинного штамма туляремийного микроба без одной копии гена iglC и без гена recA. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; (3):33–9.Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Titareva G.M., Bakhteeva I.V., Mironova R.I., Kombarova T.I., Kravchenko T.B., Dyatlov I.A., Pavlov V.M. [Constraction and properties of the Francisella tularensis vaccine strain without one copy of iglC gene and without recA gene]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology, and Virology]. 2015; (3):33–9.Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир; 1976. 440 с.Miller D. [Experiments in Molecular Genetics]. Moscow: “Mir”; 1976. 440 p.Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Проблемы особо опасных инфекций. 2009; (4):66–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2009-4(102)-66-67.Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Domotenko L.V., Khramov M.V. [Simple liquid nutrient medium for moleculargenetic investigations of Francisella tularensis]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2009; (4):66–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2009-4(102)-66-67.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 480 с.Maniatis T., Frich E., Sembruk Dzh. [Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning]. Moscow: “Mir”; 1984. 480 p.Шишкова Н.А., Вахрамеева Г.М., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Дятлов И.А. Плазмидная криотрансформация вакцинного штамма Francisella tularensis 15 линии НИИЭГ. Бактериология. 2018; 3(2):38–42. DOI: 10.20953/2307-6631-2018-2-38-42.Shishkova N.A., Vakhrameeva G.M., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Dyatlov I.A. [Plasmid cryo-transformation of the vaccine strain Francisella tularensis 15 NIIEG]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2018; 3(2):38–42. DOI: 10.20953/2307-6631-2018-2-38-42.Lessard J.C. Transformation of E. coli via electroporation. Methods Enzymol. 2013; 529:321–7. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00027-6.Lessard J.C. Transformation of E. coli via electroporation. Methods Enzymol. 2013; 529:321–7. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00027-6.National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (D.C.): National Academy Press; 2011. 220 p. DOI: 10.17226/12910.National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (D.C.): National Academy Press; 2011. 220 p. DOI: 10.17226/12910.Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. С. 85–104.Ashmarin I.P., Vorob’ev A.A. [Statistical Methods in Microbiological Research]. Leningrad: “Medgiz”; 1962. P. 85–104.Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M., Sellati T.J. Superoxide dismutase B gene (sodB)deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence. J. Bacteriol. 2006; 188(17):6443–8. DOI: 10.1128/JB.00266-06.Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M., Sellati T.J. Superoxide dismutase B gene (sodB)deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence. J. Bacteriol. 2006; 188(17):6443–8. DOI: 10.1128/JB.00266-06.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.