microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2015-2-79-82microbe-232Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGY, IMMUNOLOGYНовый эффективный способ получения очищенной В-суъединицы холерного токсина и моноклональных антител к нейNew Advantageous Method for the Production of Purified Cholera Toxin B-Subunit and Monoclonal Antibodies to ItЗахароваТ. Л.ZakharovaT. L.rusrapi@microbe.ruМихееваЕ. А.MikheevaE. A.rusrapi@microbe.ruОсинаН. А.OsinaN. A.rusrapi@microbe.ruРоссийский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201520062015027982Copyright © Захарова Т.Л., Михеева Е.А., Осина Н.А., 20152015Захарова Т.Л., Михеева Е.А., Осина Н.А.Zakharova T.L., Mikheeva E.A., Osina N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/232

Представлен эффективный способ получения В-субъединицы холерного токсина, преимуществом которого является относительная простота и экономичность, а также максимальный выход очищенной В-субъединицы, полностью лишенной примеси токсичной субъединицы А. Это достигается использованием рекомбинантного штамма холерного вибриона, продуцирующего вместо холерного токсина только его В-субъединицу, благодаря чему выделяемый препарат не обладает остаточной токсичностью. В данной работе мы использовали метод колоночной гельпроникающей хроматографии, который обеспечивает сохранение стабильного нативного состояния и максимальный выход антигена. Предлагаемый способ был отработан опытным путем, в процессе которого после каждого этапа колоночной гель-хроматографии на TSK-геле HW-60 чистоту образца анализировали с помощью диск-электрофореза, в результате чего выяснили, что трех ступеней очистки достаточно для получения лишенного примесей препарата В-субъединицы холерного токсина. Иммунологическая активность очищенной В-субъединицы подтверждена получением моноклональных антител. Полученный препарат В-субъединицы холерного токсина и моноклональные антитела к ней могут служить основой конструирования различных вариантов иммунодиагностических тест-систем.

Put forward is an efficient method for manufacturing cholera toxin B-subunit. Its advantages are relative simplicity and economy feasibility, as well as maximum output of the purified B-subunit, absolutely free from toxic A-subunit contaminant. All this is due to the deployment of cholera vibrio recombinant strain producing only cholera toxin B-subunit instead of cholera toxin as it is, which results in lack of residual preparation toxicity. Applied has been gel-penetration column chromatography, providing for stable native state and maximum antigen output. The method under discussion is verified experimentally. Sample purity has been analyzed after each phase of chromatographic investigation on TSK gel HW-60, using disc electrophoresis. It is established that three steps of purification are ample for the obtainment of cholera toxin B-subunit preparation free from admixtures. Immunological activity of the purified B-subunit is validated by monoclonal antibody obtainment. Designed preparation of cholera toxin B-subunit and monoclonal antibodies to it can serve as a basis for the development of various immune-diagnostic test-systems alternatives.

В-субъединица холерного токсинагель-хроматографияVibrio choleraecholera toxin B-subunitgel-penetration column chromatographyReferencesЗахарова Т.Л., Киреев М.Н., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae. Патент 2456996 РФ, опубл. 27.07.2012. Бюл. № 21.Zakharova T.L., Kireev M.N., Livanova L.F., Zadnova S.P., Smirnova N.I. [Method for the production of purified cholera toxin B-subunit from recombinant Vibrio cholerae strain]. RF Patent 2456996, 27.07.2012.Захарова Т.Л., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Получение очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholera. Биотехнология. 2003; 5:53-6.Zakharova T.L., Livanova L.F., Zadnova S.P., Smirnova N.I. [Obtainment of purified cholera toxin B-subunit from recombinant Vibrio cholerae strain]. Biotekhnologia. 2003; 5:53–6.Клюева С.Н., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Захарова Т.Л., Белякова Н.И., Еремин С.А., Никифоров А.К. Иммунобиологическая характеристика В-субъединицы холерного токсина. Пробл. особо опасных инф. 2012; 3(113):67-70.Klyueva S.N., Shchukovskaya T.N., Shmel’kova T.P., Kravtsov A.L., Zakharova T.L., Belyakova N.I., Eremin S.A., Nikiforov A.K. [Immunobiological characteristics of cholera toxin B-subunit]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; 3(113):67–70.Смирнова Н.И., Крепостнова И.М., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Еремин С.А., Ильина Т.С. Авирулентный штамм Vibrio cholera - продуцент В-субъединицы холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2007; 4:7-13.Smirnova N.I., Krepostnova I.M., Livanova L.F., Zadnova S.P., Eremin S.A., Il’ina T.S. [Avirulent Vibrio cholerae strain – producer of cholera toxin B-subunit: construction and molecular-genetic analysis]. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2007; 4:7–13.Янишевский Н.В., Гинцбург А.Л., Вертиев Ю.В., Демме Ю.М., Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1987; 4:26-32.Yanishevsky N.V., Gintsburg A.L., Vertiev Yu.V., Demme Yu.M., Karataev G.I., Smirnov G.B. [Constructing of recombinant plasmids, encoding cholera toxin B-subunit biosynthesis]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 1987; 4:26–32.Black R.E., Levine M.M., Clements M.L. Protective efficacy in humans of killed whole-vibrio oral cholera vaccine with and without the B subunit of cholera toxin. Infect. Immun. 1987; 5:1116-20.Black R.E., Levine M.M., Clements M.L. Protective efficacy in humans of killed whole-vibrio oral cholera vaccine with and without the B subunit of cholera toxin. Infect. Immun. 1987; 5:1116–20.Craig J.P. Cholera toxins. In: Microbial toxins. New York: Academic Press; 1971. Vol. 2A. P. 189-254.Craig J.P. Cholera toxins. In: Microbial toxins. New York: Academic Press; 1971. Vol. 2A. P. 189–254.Dertzbaugh M.T., Macrina F.L. Cholera toxin B-subunit gene fusion: Structure and functional analysis of the chimeric protein. Infect. Immun. 1990; 58(1):70-9.Dertzbaugh M.T., Macrina F.L. Cholera toxin B-subunit gene fusion: Structure and functional analysis of the chimeric protein. Infect. Immun. 1990; 58(1):70–9.Finkelstein R.A. The cholera enterotoxins and the cholera toxin-related enterotoxins : from the beginning to the present. Bacterial Protein Toxins. Zbl. Bakt. Suppl. 1992; 23:161-71.Finkelstein R.A. The cholera enterotoxins and the cholera toxinrelated enterotoxins : from the beginning to the present. Bacterial Protein Toxins. Zbl. Bakt. Suppl. 1992; 23:161–71.Galfré G. Antibodies to major histocompat ibility antigens prodused by hybrid cell lines. Nature. 1977; 266:550-2.Galfré G. Antibodies to major histocompat ibility antigens prodused by hybrid cell lines. Nature. 1977; 266:550–2.Laemmli U.K. Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680-5.Laemmli U.K. Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680–5.Lai C.Y., Mendez E., Chang D. Chemistry of cholera toxin: the subunit structure. J. Infect. Dis. 1976; 133:23-30.Lai C.Y., Mendez E., Chang D. Chemistry of cholera toxin: the subunit structure. J. Infect. Dis. 1976; 133:23–30.Lycke N., Holmgren J. Strong adiuvant properties of cholera toxin on gut mucosal immune response to orally presented antibodies. Immunology.1986; 59:301-8.Lycke N., Holmgren J. Strong adiuvant properties of cholera toxin on gut mucosal immune response to orally presented antibodies. Immunology.1986; 59:301–8.Nursin S., Khan Y.K., Bhuiyan N.A. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholerae is endemic in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(12):5854-6.Nursin S., Khan Y.K., Bhuiyan N.A. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholerae is endemic in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(12):5854–6.Ouchterlony O. Antigens antibody reactions on gels. Act. Pathol. Microbiol. Scand. 1949; 26:207-12.Ouchterlony O. Antigens antibody reactions on gels. Act. Pathol. Microbiol. Scand. 1949; 26:207–12.Taylor D.N., Cardenas V., Sanchez J.L. Two year study of the protective efficacy of the oral whole cell plus recombinant B subunit cholerae vaccine in Peru. J. Infect. Dis. 2000; 181:667-73.Taylor D.N., Cardenas V., Sanchez J.L. Two year study of the protective efficacy of the oral whole cell plus recombinant B subunit cholerae vaccine in Peru. J. Infect. Dis. 2000; 181:667–73.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.