microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2026-2-163-171microbe-2358Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПолучение хроматографически очищенного противооспенного иммуноглобулина из сыворотки крови лошадейThe Preparation of Chromatographically Purified Anti-Smallpox Immunoglobulin from Equine Blood Serumhttps://orcid.org/0000-0003-3497-5829МельниковС. А.Mel’nikovS. A.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

БорисевичС. В.BorisevichS. V.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

48cnii@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4236-1368КутаевД. А.KutaevD. A.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0008-7287-2488РождественскийЕ. В.RozhdestvenskyE. V.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0004-3145-9989БабичевА. Е.BabichevA. E.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0000-0002-6686-320XХмелевА. Л.KhmelevA. L.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0000-0002-1491-6293ЧерниковаН. К.ChernikovaN. K.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0009-0895-1533НимирскаяС. А.NimirskayaS. A.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0008-1667-7485ПопадюкЕ. Е.PopadyukE. E.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0005-3703-9237АнаньинаГ. А.Anan’inaG. A.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0009-0006-2163-4776НазаровС. В.NazarovS. V.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

https://orcid.org/0000-0002-7985-5516СтовбаЛ. Ф.StovbaL. F.

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11

11, Oktyabrskaya St., Sergiev Possad-6, Moscow Region, 141306

48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской ФедерацииРоссия48th Central Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation20262207202602163171Copyright © Мельников С.А., Борисевич С.В., Кутаев Д.А., Рождественский Е.В., Бабичев А.Е., Хмелев А.Л., Черникова Н.К., Нимирская С.А., Попадюк Е.Е., Ананьина Г.А., Назаров С.В., Стовба Л.Ф., 20262026Мельников С.А., Борисевич С.В., Кутаев Д.А., Рождественский Е.В., Бабичев А.Е., Хмелев А.Л., Черникова Н.К., Нимирская С.А., Попадюк Е.Е., Ананьина Г.А., Назаров С.В., Стовба Л.Ф.Mel’nikov S.A., Borisevich S.V., Kutaev D.A., Rozhdestvensky E.V., Babichev A.E., Khmelev A.L., Chernikova N.K., Nimirskaya S.A., Popadyuk E.E., Anan’ina G.A., Nazarov S.V., Stovba L.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/2358

Цель работы – получить хроматографически очищенный противооспенный иммуноглобулин из сыворотки крови лошадей и оценить его свойства. Материалы и методы. В работе использована сыворотка крови лошадей, содержащая антитела к вирусу вакцины, штамм Л-ИВП. Хроматографическую очистку сыворотки проводили на препаративном хроматографе Akta Avant (GE HealthCare, Швеция), контроль молекулярных параметров на стадиях получения иммуноглобулина осуществляли на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии LC-20ad (Shimadzu, Япония). Биологические свойства иммуноглобулина оценивали на кроликах, белых мышах, морских свинках. Уровень специфических вируснейтрализующих антител определяли в реакции нейтрализации на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) 12-суточных куриных эмбрионов. Результаты и обсуждение. Разработана технология получения хроматографически очищенного противооспенного иммуноглобулина из сыворотки крови лошади. На начальном этапе иммунную сыворотку крови лошадей очищали фильтрованием через стекловолоконные фильтры кассетного типа от фибринового осадка, остаточного количества липидов и липопротеинов, а затем осаждали иммуноглобулиновую фракцию насыщенным раствором сульфата аммония. На следующем этапе с помощью ионообменной хроматографической очистки из рабочего раствора удаляли соли аммония, низкомолекулярные фракции, остаточные количества альбуминов и эуглобулины. На заключительном этапе, используя гель-фильтрацию, избавлялись от димеров, полимеров и агрегатов иммуноглобулинов. Приготовленные по разработанной технологии опытные серии иммуноглобулина характеризовались высокой степенью очистки. Содержание мономеров в готовом препарате составляло не менее 99 %, а специфическая активность по уровню специфических вируснейтрализующих антител – не менее 1:16000.

The aim of the work was to obtain chromatographically purified anti-smallpox immunoglobulin from equine blood serum and evaluate its properties. Materials and methods. The horse blood serum containing antibodies to the vaccine virus, L-IVP strain, was used. Сhromatographic purification of serum was carried out on Akta Avant preparative chromatograph (GE HealthCare, Sweden), molecular parameter control at the stages of immunoglobulin production was conducted on the LC-20ad HPLC system (Shimadzu, Japan). The biological properties of immunoglobulin were evaluated in rabbits, white mice, and guinea pigs. The level of specific virus neutralizing antibodies was determined in the neutralization reaction on the chorionallantoic membrane (CAМ) of 12-day chicken embryos. Results and discussion. The technology for obtaining chromatographically purified anti-smallpox immunoglobulin from equine blood serum has been developed. At the initial stage, the immune blood serum of horses was purified by filtration through glass fiber cassette-type filters from fibrin sediment, residual quantity of lipids and lipoproteins, and then the immunoglobulin fraction was precipitated with a saturated solution of ammonium sulfate. At the next stage, ammonium salts, low molecular weight fractions, residual quantity of albumins and euglobulins were removed using ion exchange chromatographic purification. At the final stage, dimers, polymers, and aggregates of immunoglobulins were eliminated using gel filtration. The experimental series of immunoglobulin prepared using the developed technology is characterized by a high degree of purification. The monomer content in the finished product is at least 99 %, and the specific activity by titer of specific neutralizing antibodies – at least 1:16000.

противооспенный иммуноглобулиниммуноглобулин Gвирус оспы обезьянвирус вакциныортопоксвирусыхроматографическая очисткаanti-smallpox immunoglobulinimmunoglobulin Gmpox virusvaccine virusorthopoxviruseschromatographic purificationReferencesВОЗ: Оспа обезьян. [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/mpox (дата обращения: 16.11.2025).[WHO: Smallpox of monkeys]. (Cited 16 Nov 2025). [Internet]. Available from: https://www.who.int/ru/news-room/factsheets/detail/mpox.ВОЗ сняла статус чрезвычайной ситуации в мире по оспе обезьян. [Электронный ресурс]. URL: https://ria.ru/20250905/ospa-2040058865.html (дата обращения: 16.11.2025).[WHO has lifted the status of a global emergency for monkeypox]. (Cited 16 Nov 2025) [Internet]. Available from: https://ria.ru/20250905/ospa-2040058865.html.Springer Y.P., Hsu C.H., Werle Z.R., Оlson E., Cooper M.P., Castrodale L.J., Fowler N., McCollum A.M., Goldsmith C.S., Emerson G.L., Wilkins K., Doty J.B., Burgado J., Gao J., Patel N., Mauldin M.R., Reynolds M.G., Satheshkumar P.S., Davidson W., Li Y., McLaughlin J.B. Novel orthopoxvirus infection in an Alaska resident. Clin. Infect. Dis. 2017; 64(12):1737–41. DOI: 10.1093/cid/cix2019.Springer Y.P., Hsu C.H., Werle Z.R., Оlson E., Cooper M.P., Castrodale L.J., Fowler N., McCollum A.M., Goldsmith C.S., Emerson G.L., Wilkins K., Doty J.B., Burgado J., Gao J., Patel N., Mauldin M.R., Reynolds M.G., Satheshkumar P.S., Davidson W., Li Y., McLaughlin J.B. Novel orthopoxvirus infection in an Alaska resident. Clin. Infect. Dis. 2017; 64(12):1737–41. DOI: 10.1093/cid/cix2019.Oliveira Silva N.I., de Oliveira J.S., Kroon E.G., de Souza Trindade G., Drumond B.P. Here, there, and everywhere: the wide host range and geogrаphic distribution of zoonotic orthopoxviruses. Viruses. 2021; 13(1):43. DOI: 10.3390/v13010043.Oliveira Silva N.I., de Oliveira J.S., Kroon E.G., de Souza Trindade G., Drumond B.P. Here, there, and everywhere: the wide host range and geogrаphic distribution of zoonotic orthopoxviruses. Viruses. 2021; 13(1):43. DOI: 10.3390/v13010043.Борисевич И.В., Маркин В.А., Фирсова И.В., Хамитов Р.А., Максимов В.А., Eвсеев А.А. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок (Марбург, Эбола, Ласса и Боливийской). Вопросы вирусологии. 2006; 51(5):8–16.Borisevich I.V., Markin V.A., Firsova I.V., Khamitov R.A., Maksimov V.A., Evseev A.A. [Epidemiology, prevention, clinical presentation and treatment of hemorrhagic fevers (Marburg, Ebola, Lassa and Bolivian)]. Voprosy Virusologii [Problems of Virology]. 2006; 51(5):8–16.Cohn E.J., Strong L.E., Hughes W.L. Jr, Mulford D.J., Ashworth J.N., Melin M., Taylor H.L. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J. Am. Chem. Soc. 1946; 68(3):459–75. DOI: 10.1021/ja01207a034.Cohn E.J., Strong L.E., Hughes W.L. Jr, Mulford D.J., Ashworth J.N., Melin M., Taylor H.L. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J. Am. Chem. Soc. 1946; 68(3):459–75. DOI: 10.1021/ja01207a034.Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И., Лебединская Е.В., Корсун Л.В., Горбунова Е.В., Слободян В.Г., Меркулов В.А., Олифер Ю.В. Препараты, полученные из крови человека и животных, в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности. Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015; (3):33–48.Supotnitsky M.V., Elapov A.A., Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu., Klimov V.I., Lebedinskaya E.V., Korsun L.V., Gorbunova E.V., Slobodyan V.G., Merkulov V.A., Olifer Yu.V. [Preparations obtained from human and animal blood in terms of their quality, efficacy and safety]. Biopreparaty. Profilaktika, Diagnostika, Lechenie [Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment]. 2015; (3): 33–48.Перелыгина О.В., Комаровская Е.И., Мухачева А.В., Саяпина Л.В., Обухов Ю.И., Бондарев В.П. Геторологичные сывороточные препараты в практике современной медицины. Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017; 17(1):41–7.Perelygina O.V., Komarovskaya E.I., Mukhacheva A.V., Sayapina L.V., Obukhov Yu.I., Bondarev V.P. [Heterologous serum preparations in the practice of modern medicine]. Biopreparaty. Profilaktika, Diagnostika, Lechenie [Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment]. 2017; 17(1):41–7.Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В., редакторы. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. М.: ВУНМЦ; 2002. 608 с.Onishchenko G.G., Aleshkin V.A., Afanasyev S.S., Pospelova V.V., editors. [Immunobiological Drugs and Prospects for Their Use in Infectology]. Moscow: VUNMC; 2002. 608 p.Jones R.G.A., Landon J. Enhanced pepsin digestion: a novel process for purifying antibody F(ab')(2) fragments in high yield from serum. J. Immunol. Methods. 2002; 263(1-2):57–74. DOI: 10.1016/s0022-1759(02)00031-5.Jones R.G.A., Landon J. Enhanced pepsin digestion: a novel process for purifying antibody F(ab’)(2) fragments in high yield from serum. J. Immunol. Methods. 2002; 263(1-2):57–74. DOI: 10.1016/s0022-1759(02)00031-5.Kazatchkine M.D., Kaveri S.V. Immunomodulation of autoimmune and inflammatory diseases with intravenous immune globulin. N. Engl. J. Med. 2001; 345(10):747–55. DOI: 10.1056/NEJMra993360.Kazatchkine M.D., Kaveri S.V. Immunomodulation of autoimmune and inflammatory diseases with intravenous immune globulin. N. Engl. J. Med. 2001; 345(10):747–55. DOI: 10.1056/NEJMra993360.Ghorbani J., Kompany-Zareh M., Tahmasebi E. Antibodies purification from human plasma using fractionation, chromatography and gel electrophoresis assisted by multivariate analysis of complimentary absorption and fluorescence spectra. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2021; 1167:122526. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122526.Ghorbani J., Kompany-Zareh M., Tahmasebi E. Antibodies purification from human plasma using fractionation, chromatography and gel electrophoresis assisted by multivariate analysis of complimentary absorption and fluorescence spectra. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2021; 1167:122526. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122526.Зубкова Н.В. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы. Биопрепараты. 2014; 1(49):4–10.Zubkova N.V. [Biotechnological aspects of efficient and safe processing of donor plasma: problems and prospects]. Biopreparaty [Biopreparations]. 2014; 1(49):4–10.Kuhlmann W.D. Purification of antibodies by use of biochemical and immunochemical techniques. [Электронный ресурс]. URL: https://www.kuhlmann-biomed.de/en/purification-ofantibodies/.Kuhlmann W.D. Purification of antibodies by use of biochemical and immunochemical techniques. [Internet]. Available from: https://www.kuhlmann-biomed.de/en/purification-of-antibodies/.Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007; 848(1):40–7. DOI: 10.1016/j.jchromb.2006.09.030.Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007; 848(1):40–7. DOI: 10.1016/j.jchromb.2006.09.030.Grodzki A.C., Berenstein E. Antibody purification: ion-exchange chromatography. Methods Mol. Biol. 2010; 588:27–32. DOI: 10.1007/978-1-59745-324-0_4.Grodzki A.C., Berenstein E. Antibody purification: ion-exchange chromatography. Methods Mol. Biol. 2010; 588:27–32. DOI: 10.1007/978-1-59745-324-0_4.Генералов И.И., Моисеева А.М., Жерулик С.В. Генералова А.Г., Железняк Н.В. Получение высокоочищенных иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови человека. Вестник фармации. 2009; 4(46):52–60.Generalov I.I., Moiseeva A.M., Zherulik S.V., Generalova A.G., Zheleznyak N.V. [Production of highly purified class G immunoglobulins from human blood serum]. Vestnik Farmatsii [Bulletin of Pharmacy]. 2009; 4(46):52–60.Борисевич С.В., Кутаев Д.А., Рождественский Е.В., Гордеев Е.В., Хмелев А.Л., Назаров С.В., Мельников С.А., Нимирская С.А., Черникова Н.К., Подкуйко В.Н. Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей. Патент РФ № 2770425 от 18.04.2022, приоритет от 15.06.2020. Бюл. № 11 от 20.04.2022.Borisevich S.V., Kutaev D.A., Rozhdestvensky E.V., Gordeev E.V., Khmelev A.L., Nazarov S.V., Melnikov S.A., Nimirskaya S.A., Chernikova N.K., Podkuiko V.N. [Method of obtaining anti-inflammatory immunoglobulin from blood serum of horses]. Patent of the Russian Federation No. 2770425 dated 04/18/2022, priority dated 06/15/2020. Bull. No. 11 dated 04/20/2022.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.