Цель работы: применение 2D-электрофореза для получения «белковых портретов» лизатов бактериальных культур возбудителей особо опасных инфекций. Материалы и методы. «Белковые портреты» получали на модели нетоксигенного штамма V. choleraе биовара Эль Тор М-888 и штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного при 28 и 37 °С. В качестве препарата сравнения использовали коммерческий образец лизата штамма E. coli . SDS-PAGE-электрофорез проводили классическим методом Lаemmli, в основу постановки 2D-электрофореза положены метод O’Farrel и рекомендации производителя. Для визуализации белков электрофореграммы окрашивали Кумасси синим G-250 или нитратом серебра. Концентрацию белка измеряли методом Бредфорда. Образцы клеточных лизатов очищали от небелковых примесей с помощью набора ReadyPrep 2-D Cleanup Kit. Результаты и выводы. Описан высокоэффективный комплексный метод разделения смеси белков, включающий этап приготовления образцов бактериальных культур в результате разрушения клеток ультразвуком в лизирующем буфере, их очистку и дальнейший анализ в одном направлении по заряду в градиенте pH, в другом направлении - по молекулярной массе методом SDS-PAGE-электрофореза. После окрашивания 2D-гели анализировали с помощью программного обеспечения Dymension мультифункциональной системы гель-документирования Syngene. Использование для ИЭФ стрипов с иммобилизованным градиентом рН заданного диапазона, коммерческих наборов реактивов и полиакриламидных гелей больших размеров позволило оптимизировать условия проведения 2D-электрофореза, сократить время, увеличить точность и воспроизводимость анализа. На модели лизатов нетоксигенного штамма V. choleraе биовара Эль Тор М-888 и штамма Y. pestis EV, выращенного при 28 и 37 °С, с помощью 2D-электрофореза получены «белковые портреты» изучаемых штаммов, показана высокая эффективность метода и возможность его использования для изучения динамики экспрессии генов возбудителей особо опасных инфекций.
Objective of the study is to deploy 2-D electrophoresis for the construction of lysate “protein profiles” of bacterial cultures of particularly dangerous infections. Materials and methods. “Protein profiles” are obtained on the model of non-toxigenic V. cholerae biovar El Tor M-888 strain and Y. pestis EV NIIEG strain, cultivated at 28 and 37 °C. Commercial sample of E. coli strain lysate serves as comparator (reference) product. SDS-PAGE-electrophoresis is carried out following classical Laemmli approach. 2D-electrophoresis is based on O’Farrel technique and manufacturer’s recommendations. For protein visualization, staining of electrophoregrams with coomassie blue G-250 and silver nitrate is used. Protein concentration (load) is evaluated with the help of Bradford protein assay. Cell lysate samples are purged of non-protein impurities applying Ready Prep 2-D Cleanup Kit. Results and conclusions. Described is a highly effective complex method of protein mixture separation, which assumes preparation of bacterial culture probes where cells are fractured under ultrasonic exposure in the lysing buffer, then purified and analyzed either in reference to the charge in pH gradient, or - to molecular mass in SDS-PAGE-electrophoresis. After the staining 2-D gels are assayed by means of “Dymension” software product, installed on the platform of multi-functional gel documentation system “Syngene”. Utilization of stripes with immobilized pH gradient of a preset range, commercial reagent kits, and large-sized polyacrylamide gels has allowed for optimization of the conditions for performing 2D-electrophoresis, reduction of the time elapsed, and improvement of accuracy and reproducibility. On the model of non-toxigenic V. cholerae biovar El Tor M-888 strain and Y. pestis EV NIIEG strain, cultivated at 28 and 37 °C, applying 2D-electrophoresis, obtained are the protein “profiles” of the investigated strains, demonstrated is high efficacy of the method and possibility of its deployment for studies of gene expression dynamics as regards agents of particularly dangerous infections.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.