microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-2-65-68microbe-308Research ArticleМИКРОБИОЛОГИЯMICROBIOLOGYРазработка иммунохроматографической моноклональной тест-системы для выявления Yersinia pseudotuberculosis серогруппы IDevelopment of Immune-Chromatographic Monoclonal Test-System for the Detection of Yersinia pseudotuberculosis, Serogroup IБогачеваН. В.BogachevaN. V.bogacheva70@mail.ruЕлагинГ. Д.ElaginG. D.noemail@neicon.ruПеченкинД. В.PechenkinD. V.noemail@neicon.ruКытмановА. А.KytmanovA. A.noemail@neicon.ruТихвинскаяО. В.TikhvinskayaO. V.noemail@neicon.ruЕрёмкинА. В.EremkinA. V.noemail@neicon.ru48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияAffiliated Branch of the «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation201620062016026568Copyright © Богачева Н.В., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Кытманов А.А., Тихвинская О.В., Ерёмкин А.В., 20162016Богачева Н.В., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Кытманов А.А., Тихвинская О.В., Ерёмкин А.В.Bogacheva N.V., Elagin G.D., Pechenkin D.V., Kytmanov A.A., Tikhvinskaya O.V., Eremkin A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/308

Цель. Разработать иммунохроматографическую моноклональную тест-систему для выявления возбудителя псевдотуберкулеза серогруппы I. Материалы и методы. В качестве специфических компонентов для разработки иммунохроматографической тест-системы были использованы мышиные моноклональные антитела гибридных клеточных линий, полученные на липолисахаридный антиген наружной мембраны «холодового» варианта псевдотуберкулезного микроба I серотипа (YP-101Н2В4, YP-105С5А10); кроличьи антивидовые антитела против иммуноглобулинов мыши. Для получения конъюгата коллоидного золота с антителами (КЗ-АТ) были использованы частицы диаметром (30±2) нм. Для конъюгирования с коллоидным золотом использовали концентрацию антител, на 10-15 % превышающую точку выхода D580 на плато. Для изготовления иммунохроматографической тест-системы применяли комплект мембран фирмы MDI Easypack («Advanced Microdevise», Индия). Готовый конъюгат наносили на мембрану методом пропитывания. Антитела в аналитическую и контрольную мембраны в выбранной концентрации наносили с помощью диспенсора. Подложку с нанесенным конъюгатом и готовые рабочие мембраны сушили в вакуумном сухожаровом шкафу. Собранные иммунохроматографические тест-системы нарезали по 4,5 мм и тестировали на специфичность и чувствительность. Результаты и выводы. Разработана иммунохроматографическая тест-система, в которой использовали моноклональные антитела гибридной клеточной линии YP-105C5A10 в конъюгате с коллоидным золотом и моноклональные антитела гибридной клеточной линии YP-101H2B4 в тестовой линии. Тест-система обеспечивает выявление штаммов Y. рseudotuberculosis серогруппы I в концентрации от 500 тыс. м.к.·см-3 (при тестировании 8 штаммов из 11 исследованных) до 4 млн м.к.·см-3 и не выявляет при исследовании близкородственные иерсинии и гетерологичные микроорганизмы в концентрации 100 млн м.к.·см-3.

Objective of the study was to develop monoclonal immunoassay for the detection of the pseudotuberculosis agent, serogroup I. Materials and methods. Specific components, that were used for immune-chromatographic test-system development were mouse monoclonal antibodies of hybrid cell lines, obtained to lipopolysaccharide antigen of the outer membrane of the pathogen’s «cold» variant (YP-101N2V4, YP-105S5A10); and rabbit anti-species antibodies against murine immunoglobulins. Particles, (30±2) nm in the diameter, were used to prepare colloidal gold-antibody conjugate. Antibody concentration for conjugation was 10-15 % greater than the D580 exit point on the plateau. For the production of immune-chromatographic test-system a set of membranes - MDI Easypack - manufactured by «Advanced Microdevice», India was deployed. Finished conjugate was applied onto the membrane by means of impregnation. Antibodies in the selected quantities were applied onto the analytical and control membranes via Dispensers. Substrates coated with the conjugate and ready-made working membranes were vacuum dried in a heat cabinet. Assembled immune-chromatographic test-systems were cut off 4.5 mm each and tested for specificity and sensitivity. Results and conclusions. Developed has been immune-chromatographic test-system for the detection of pseudotuberculosis pathogen, serogroup I. Utilized have been monoclonal antibodies of the hybrid cell line YP-105C5A10 in colloidal gold conjugate and monoclonal antibodies of the hybrid cell line YP-101H2B4 in the test line. The test-system allows for the detection of Y. pseudotuberculosis strains, serogroup I, at concentrations varying from 500 ths. m.c.·cm-3 (8 of the 11 strains under study) up to 4 million m.c.·cm-3 and does not identify closely related yersinia and heterologous microorganisms in quantities of 100 million m.c.·cm-3.

возбудитель псевдотуберкулеза серогруппы Iмоноклональные антителаиммунохроматографическая тест-системаpseudotuberculosis agentserogroup Imonoclonal antibodiesimmune-chromatographic test-systemReferencesБалахонов С.В., Косилко С.А., Бренёва Н.В., Мазепа А.В., Окунев Л.П., Климов В.Т., Никитин А.Я., Сидорова Е.А., Севостьянова А.В., Трушина Ю.Н., Мельникова О.В., Ярыгина М.Б., Худченко С.Э., Чеснокова М.В., Андаев Е.И. Эпидемиологическая ситуация по природно-очаговым инфекционным болезням бактериальной и вирусной этиологии в 2012 г. в Сибири и на Дальнем Востоке и прогноз ее развития на 2013 г. Пробл. особо опасных инф. 2013; 1:38-43.Balakhonov S.V., Kosilko S.A., Breneva N.V., Mazepa A.V., Okunev L.P., Klimov V.T., Nikitin A.Ya., Sidorova E.A., Sevost’yanova A.V., Trushina Yu.N., Mel’nikova O.V., Yarygina M.B., Khudchenko S.E., Chesnokova M.V., Andaev E.I. [Epidemiological situation on natural focal infectious diseases of bacterial and viral etiology in 2012 in the territory of Siberia and Far East, and prognosis for 2013]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2013; 1:38–43.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: практическое руководство. 2-е изд. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases: Practice Guidelines]. 2nd edition. M.: “Shiko”; 2013. 560 p.Покровский В.И., Сомов Г.П., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина; 2001. 256 с.Pokrovsky V.I., Somov G.P., Besednova N.N., Antonenko F.F. [Pseudotuberculosis]. M.: “Meditsin”; 2001. 256 p.Ценева Г.Я., Воскресенская Е.А., Солодовникова Н.Ю. Биологические свойства иерсиний и лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза: пособие для врачей. СПб.; 2001. С. 28-34.Tseneva G.Ya., Voskresenskaya E.A., Solodovnikova N.Y. [Biological Properties of Yersinia and Laboratory Diagnostics of Pseudotuberculosis and Yersiniosis: Guide Book for Medical Officers]. St. Petersburg; 2001. P. 28–34.Ющук Н.Д., Шестакова И.В. Псевдотуберкулез. Инфекционные болезни: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2009. С. 352-62.Yushchuk N.D., Shestakova I.V. [Pseudotuberculosis. Infectious Diseases: National Guidelines]. M.: “GEOTAR-Media”; 2009. P. 352–62.Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk. Talanta. 2010; 81(3):843-8.Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk. Talanta. 2010; 81(3):843–8.Frens G. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions. Nat. Phys. Sci. 1973; 241:20-2. DOI: 10.1038/physci241020a0.Frens G. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions. Nat. Phys. Sci. 1973; 241:20–2. DOI: 10.1038/physci241020a0.Hermanson G.T. Bioconjugat Techniques. 2nd Edition. Amsterdam: Acad. Press; 2008.Hermanson G.T. Bioconjugat Techniques. 2nd Edition. Amsterdam: Acad. Press; 2008.von Lode P. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 2005; 38(7):591-606. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2005.03.008.von Lode P. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 2005; 38(7):591–606. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2005.03.008.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.