microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-3-47-51microbe-325Research ArticleМИКРОБИОЛОГИЯMICROBIOLOGYРазработка тест-системы для дифференциации видов бруцелл методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времениDevelopment of the Test-System for Differentiation of Brucella Species, Using Real-Time PCRКасьянЖ. А.Kas’yanZh. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruОсинаН. А.OsinaN. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ЩербаковаС. А.ShcherbakovaS. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201620092016034751Copyright © Касьян Ж.А., Осина Н.А., Щербакова С.А., 20162016Касьян Ж.А., Осина Н.А., Щербакова С.А.Kas’yan Z.A., Osina N.A., Shcherbakova S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/325Цель работы

Цель работы. создание тест-системы, позволяющей проводить видовую идентификацию возбудителя бруцеллеза с помощью полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы

Материалы и методы. Проведен анализ литературных источников и нуклеотидных последовательностей Brucella spp. с помощью специализированного программного обеспечения для выбора ДНК -мишеней, специфичных для каждого вида бруцелл, разработан методический прием и набор реагентов для идентификации видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции с применением термоциклера с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типа RotorGene.

Результаты и выводы

Результаты и выводы. Разработана тест-система, позволяющая провести дифференциацию видов или группы видов бруцелл: B. abortus/B. ovis; B. melitensis; B. suis/B. canis; B. neotomae методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. В качестве ДНК -мишеней выбраны гены BR0262, BRA0541-0542, BMEII0711, которые полностью или частично делетированы у разных видов бруцелл.

Objective of the study is to construct a test-system allowing for specific identification of brucellosis agent, using real-time polymerase chain reaction.

Materials and methods

Materials and methods. Carried out has been analysis of literature sources and nucleotide sequences of Brucella spp., applying the specialized software for DNA-target sequence selection, specific for each brucella species. Developed is methodological tool and reagent panel for identification of brucellosis agent species appurtenance by means of RT PCR using thermocycler with hybridization-fluorescent registration of results, RotorGene type.

Results and conclusions

Results and conclusions. Developed is the test-system, providing for differentiation of brucella species or group of species: B. abortus/B. ovis; B. melitensis; B. suis/B. canis; B. neotomae, applying real-time polymerase chain reaction. BR0262, BRA0541-0542, BMEII0711 genes are selected as DNA-targets, being completely or partially deleted in different species of brucella.

идентификациябруцеллывидовая принадлежностьПЦР с учетом результатов в режиме реального времениidentificationbrucellaspecies appurtenancereal-time PCRReferencesО нищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: Медицина; 2013. С. 191.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases]. M.: Meditsina; 2013. P. 191.П рофилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. МУ 3.1.7.1189–03. М.; 2003.[Prophylaxis and laboratory diagnostics of brucellosis in humans]. MR 3.1.7.1189-03. M.; 2003.П орядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУК 4.2.3010-12. М.; 2013. 24 с.[Procedure for organization and carrying out of laboratory diagnostics of brucellosis for the facilities at the territorial, regional, and federal levels]. MR 4.2.3010-12. M.; 2013. 24 p.Bricker B.J., Halling S.M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4 Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiol. 1994; 32:2660–6.Bricker B.J., Halling S.M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4 Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiol. 1994; 32:2660–6.Halling S.M., Peterson-Burch B.D., Bricker B.J., Zuerner R.L., Qing Z., Li L.L., Kapur V., Alt D.P., Olsen S.C. Completion of the genome sequence of Brucella abortus and comparison to the highly similar genomes of Brucella melitensis and Brucella suis. J. Bacteriol. 2005; 187(8):2715–26. DOI: 10.1128/JB.187.8.2715- 2726.2005.Halling S.M., Peterson-Burch B.D., Bricker B.J., Zuerner R.L., Qing Z., Li L.L., Kapur V., Alt D.P., Olsen S.C. Completion of the genome sequence of Brucella abortus and comparison to the highly similar genomes of Brucella melitensis and Brucella suis. J. Bacteriol. 2005; 187(8):2715–26. DOI: 10.1128/JB.187.8.2715-2726.2005.Hinić V., Brodard I., Thomann A., Cvetnić Ž., Makaya P.V., Frey J., Abril C. Novel identification and differentiation of Brucella melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis, and B. neotomae suitable for both conventional and real-time PCR systems. J. Microbiol. Methods. 2008; 75:375–8. DOI: 10.1016/j.mimet.2008.07.002.Hinić V., Brodard I., Thomann A., Cvetnić Ž., Makaya P.V., Frey J., Abril C. Novel identification and differentiation of Brucella melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis, and B. neotomae suitable for both conventional and real- time PCR systems. J. Microbiol. Methods. 2008; 75:375–8. DOI: 10.1016/j.mimet.2008.07.002.Leal–Klevezas D.S., Martinez V.I.O., Lopez M.A., Martinez S.J.P. Single step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals. J. Clin. Microbiol. 1995; 33(12):3087–90.Leal–Klevezas D.S., Martinez V.I.O., Lopez M.A., Martinez S.J.P. Single step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals. J. Clin. Microbiol. 1995; 33(12):3087–90.Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckeart A., Ferreira A.C., Carloso R., Correa de Sa M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruceladder) for molecular typing of all Brucella species including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 3484–7. DOI: 10.1128/ JCM.00837-08.Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckeart A., Ferreira A.C., Carloso R., Correa de Sa M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 3484–7. DOI: 10.1128/JCM.00837-08.Loґpez-Goni I., Garcıґa-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzmaґ n- Verri C., Albert D., Garin- Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154:152–5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.Loґpez-Goni I., Garcıґa-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzmaґ n-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154:152–5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.Newby D.T., Hadfield T.L., Roberto F.F. Real-Time PCR detection of Brucella abortus: a comparative study of SYBR Green I, 5’-Exonuclease, and Hybridization Probe Assays. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69(8):4753–9. DOI: 10.1128/AEM.69.8.4753- 4759.2003.10 Newby D.T., Hadfield T.L., Roberto F.F. Real-Time PCR detection of Brucella abortus: a comparative study of SYBR Green I, 5’-Exonuclease, and Hybridization Probe Assays. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69(8):4753–9. DOI: 10.1128/AEM.69.8.4753-4759.2003.Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1290–3. DOI: 10.1128/JCM.42.3.1290-1293.2004.Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1290–3. DOI: 10.1128/ JCM.42.3.1290-1293.2004.Rajashekara G., Glasner J.D., Glover D.A., Splitter G.A. Comparative whole-genome hybridization reveals genomic islands in Brucella species. J. Bacteriol. 2004; 186(15):5040– 51. DOI: 10.1128/ JB.186.15.5040-5051.2004.Rajashekara G., Glasner J.D., Glover D.A., Splitter G.A. Comparative whole- genome hybridization reveals genomic islands in Brucella species. J. Bacteriol. 2004; 186(15):5040–51. DOI: 10.1128/JB.186.15.5040-5051.2004.Ratushna V.G., Sturgill D.M., Ramamoorthy S., Reichow S.A., He Y., Lathigra R., Striranganathan N., Halling S.M., Boyle S.M., Gibas C.J. Molecular targets for rapid identification of Brucella spp. BMS Microbiol. 2006; 6:13. DOI: 10.1186/1471-2180-6-13.Ratushna V.G., Sturgill D.M., Ramamoorthy S., Reichow S.A., He Y., Lathigra R., Striranganathan N., Halling S.M., Boyle S.M., Gibas C.J. Molecular targets for rapid identification of Brucella spp. BMS Microbiol. 2006; 6:13. DOI: 10.1186/1471-2180-6- 13.Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella melitensis, and Brucella suis. Mol. Cell. Probes. 2001; 15(1):43–52. DOI: 10.1006/ mcpr.2000.0338.Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella melitensis, and Brucella suis. Mol. Cell. Probes. 2001; 15(1):43–52. DOI: 10.1006/mcpr.2000.0338

The authors declare that there are no conflicts of interest present.