microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-3-81-84microbe-332Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGY, IMMUNOLOGYСовершенствование технологии получения живой туляремийной вакциныEnhancement of the Technology for Live Tularemia Vaccine ProductionВолохО. А.VolokhO. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruКомиссаровА. В.KomissarovA. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

АнтонычеваМ. В.AntonychevaM. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ЛобовиковаО. А.LobovikovaO. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

АвдееваН. Г.AvdeevaN. G.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ВахрушинаН. И.VakhrushinaN. I.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

МироноваН. П.MironovaN. P.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

БибиковД. Н.BibikovD. N.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

НикифоровА. К.NikiforovA. K.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201620092016038184Copyright © Волох О.А., Комиссаров А.В., Антонычева М.В., Лобовикова О.А., Авдеева Н.Г., Вахрушина Н.И., Миронова Н.П., Бибиков Д.Н., Никифоров А.К., 20162016Волох О.А., Комиссаров А.В., Антонычева М.В., Лобовикова О.А., Авдеева Н.Г., Вахрушина Н.И., Миронова Н.П., Бибиков Д.Н., Никифоров А.К.Volokh O.A., Komissarov A.V., Antonycheva M.V., Lobovikova O.A., Avdeeva N.G., Vakhrushina N.I., Mironova N.P., Bibikov D.N., Nikiforov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/332Цель исследования

Цель исследования. Разработка и апробация новых биотехнологических приемов в технологии получения живой туляремийной вакцины.

Материалы и методы

Материалы и методы: Штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ использовали в качестве штамма-продуцента, штамм F. tularensis 503 – в качестве тест-заражающего. Проводили культивирование штамма-продуцента на плотных и жидких питательных средах, тангенциальную ультрафильтрацию на ультра-микрофильтрационной установке «Вива-флоу», лиофилизацию в сублимационной сушильной установке FreeZone 2,5 L.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. Использование сконструированной жидкой питательной среды на основе ферментативного гидролизата фибрина и применение глубинного культивирования штамма-продуцента позволило увеличить выход биомассы. На этапе концентрирования культуры туляремийного микроба методом микрофильтрации через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости увеличено содержание микробных клеток и проведено освобождение от остатков питательной среды. Проведенный сравнительный анализ полученных по экспериментальной технологии лабораторных серий вакцины с коммерческим препаратом вакцины туляремийной живой показал их соответствие нормативным свойствам. Установлено, что применение новой жидкой питательной среды, глубинного культивирования, способов концентрирования и сепарации биомассы не оказывает отрицательного влияния на основные свойства живой туляремийной вакцины и в дальнейшем позволит в значительной степени повысить технологичность производства.

Objective of the study was to develop and test new biotechnological approaches for live tularemia vaccine production.

Materials and methods

Materials and methods: Francisella tularensis 15 NIIEG strain was used as producer-strain; Francisella tularensis 503 strain – as test infecting one. Producer strain was cultivated on solid and liquid nutrient media. Tangential ultrafiltration was performed with the help of microfiltration module “Viva-flow”. Lyophilization was conducted using drying installation – Free Zone 2.5 L.

Results and discussion

Results and discussion: Application of the designed liquid nutrient medium on the basis of enzymatic fibrin hydrolysate and submerged cultivation of the producer-strain has allowed for a significant biomass yield increment. At the stage of tularemia microbe culture concentration via microfiltration through filtering membranes with pore size of 0.2 μm, in the mode of tangential liquid flow, increased has been the content of microbe cells; the nutrient media residues – removed. Comparative analysis of the obtained in accordance with experimental technique laboratory series of the vaccine and commercial preparation of live tularemia vaccine has demonstrated their conformity with the specific normative properties. It is established that application of modified liquid nutrient medium, submerged cultivation conditions, methods of biomass concentration and separation has no negative influence on the main properties of live tularemia vaccine and will provide for considerable produce-ability increase in the future.

Francisella tularensisживая туляремийная вакцинапитательная средакультивированиеультрафильтрацияFrancisella tularensislive tularemia vaccinenutrient mediumcultivationultra-filtrationReferencesВолох О.А., Антонычева М.В., Авдеева Н.Г., Вахрушина И.И., Никифоров А.К. Питательная среда для глубинного культивирования туляремийного микроба. Патент 2518282 РФ. Бюл. № 16, опубл. 10.06.2014.Volokh O.A., Antonycheva M.V., Avdeeva N.G., Vakhrushina I.I., Nikiforov A.K. [Nutrient medium for submerged cultivation of tularemia microbe]. RF Patent No 2518282, 10.06.2014.Волох О.А., Комиссаров А.В., Никифоров А.К., Самохвалова Ю.И., Авдеева Н.Г. Способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины. Патент 2528878 РФ. Бюл. № 26, опубл. 20.09.2014Volokh O.A., Komissarov A.V., Nikiforov A.K., Samokhvalova Yu.I., Avdeeva N.G. [Method for the production of microbe cell concentrate for manufacturing live tularemia vaccine]. RF Patent No 2528878, 20.09.2014.Кисличкин Н.Н., Кисличкина О.Н. Живая туляремийная вакцина Nik-sp. Francisella tularensis. Патент 2308969 РФ. Бюл. № 30, опубл. 27.10.07.Kislichkin N.N., Kislichkina O.N. [Live tularemia vaccine Nik –sp. Francisella tularensis]. RF Patent No 2308969, 27.10.07.Мещерякова И.С. Туляремия. В кн.: Природная очаговость болезней: исследования института им. Н .И.ГамалеиРАМН . М.; 2003. С. 137–60.Meshcheryakova I.S. [Tularemia]. In: [Natural Focality of Diseases: Studies of the RAMS Research Institute after the Name of N.I.Gamaleya]. M.; 2003. P. 137–60.Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 190 с.Olsuf’ev N.G. [Taxonomy, Microbiology, and Laboratory Diagnostics of Tularemia Agent]. M.: Meditsina; 1975. 190 p.Павлов В.М., Дятлов И.А. Молекулярно-генетические исследования бактерий рода Francisella и их прикладное значение. М.: ООО «ТиРу»; 2012. 267 с.Pavlov V.M., Dyatlov I.A. [Molecular-Genetic Studies of Bacteria Francisella and their Applied Significance]. M.:”TiRu” Ltd.; 2012. 267 p.Шепелёв И.А., Волох О.А., Еремин С.А., Авдеева Н.Г., Кузнецова Е.М. Способ получения биомассы туляремийного микроба. Патент 2451743 РФ. Бюл. № 15, опубл. 27.05.2012.Shepelev I.A., Volokh O.A., Eremin S.A., Avdeeva N.G., Kuznetsova E.M. [Method of tularemia microbe biomass production]. RF Patent No 2451743, 27.05.2012.Barry E.M., Cole L.E., Santiago A.E. Vaccine against tularemia. Hum. Vaccine. 2009; 5(12):832–8. DOI: 10.4161/hv.10297.Barry E.M., Cole L.E., Santiago A.E. Vaccine against tularemia. Hum. Vaccine. 2009; 5(12):832–8. DOI: 10.4161/hv.10297.Conlan J.W., Oyston P.C.F. Vaccines against Francisella tularensis. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:325–50. DOI: 10.1196/ annals.1409.012.Conlan J.W., Oyston P.C.F. Vaccines against Francisella tularensis. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:325–50. DOI: 10.1196/annals.1409.012.Forslund A.L., Kuoppa., Svensson K., Salomonsson E., Johansson A., Bystro M., Oyston P.C.F., Michell S.L., Titball R.W. Direct repeat-mediated deletion of a type IV pilin gene results in major virulence attenuation of Francisella tularensis. Mol. Microbiol. 2006; 59:1818–30. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05061.x.Forslund A.L., Kuoppa., Svensson K., Salomonsson E., Johansson A., Bystro M., Oyston P.C.F., Michell S.L., Titball R.W. Direct repeat-mediated deletion of a type IV pilin gene results in major virulence attenuation of Francisella tularensis. Mol. Microbiol. 2006; 59:1818–30. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05061.x.Jia Q., Lee B.Y., Bowen R. Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) mutant with a deletion in capB, encoding a putative capsular biosynthesis protein, is significantly more attenuated than LVS yet induces potent protective immunity in mice against F. tularensis challenge. Infect. Immun. 2010; 78(10):4341–55. DOI: 10.1128/ IAI.00192-10.Jia Q., Lee B.Y., Bowen R. Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) mutant with a deletion in capB, encoding a putative capsular biosynthesis protein, is significantly more attenuated than LVS yet induces potent protective immunity in mice against F. tularensis challenge. Infect. Immun. 2010; 78(10):4341–55. DOI: 10.1128/IAI.00192-10.Marohn M.E., Barry E.M. Live attenuated tularemia vaccines: recent developments and future goals. Vaccine. 2013; 31(35):3485–91. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.096.Marohn M.E., Barry E.M. Live attenuated tularemia vaccines: recent developments and future goals. Vaccine. 2013; 31(35):3485–91. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.096.Reed D.S., Smith L’K.P., Cole K.S., Santiago A.E., Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 2(5):2098–2105. DOI: 10.1128/IAI.01498-14.Reed D.S., Smith L’K.P., Cole K.S., Santiago A.E., Mann B.J., Barry E.M. Live attenuated mutants of Francisella tularensis protect rabbits against aerosol challenge with a virulent type A strain. Infect. Immun. 2014; 2(5):2098–2105. DOI: 10.1128/IAI.01498-14.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.