microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-3-90-94microbe-334Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGY, IMMUNOLOGYПути оптимизации синтеза олигонуклеотидов при производстве препаратов для генной диагностики особо опасных инфекционных болезнейApproaches to Optimization of Oligonucleotide Synthesis during Manufacturing of Preparations for Gene Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious DiseasesСтепановА. В.StepanovA. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

rusrapi@microbe.ruМайоровН. В.MayorovN. V.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ОсинаН. А.OsinaN. A.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

НикифоровА. К.NikiforovA. K.

Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Russian Federation201620092016039094Copyright © Степанов А.В., Майоров Н.В., Осина Н.А., Никифоров А.К., 20162016Степанов А.В., Майоров Н.В., Осина Н.А., Никифоров А.К.Stepanov A.V., Mayorov N.V., Osina N.A., Nikiforov A.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/334Цель работы

Цель работы. Изучение влияния активатора, окислителя и деблокирующего раствора на количественный выход олигонуклеотидов при производстве тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол».

Материалы и методы

Материалы и методы. В качестве объекта исследований были выбраны праймеры ctx2 и ctx3, входящие в состав «Тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол». Для проведения исследований использовали экспериментальные составы растворов для деблокирования, активатора и окислителя и «стандартные» растворы, рекомендованные производителем ООО «Биоссет». Специфическую активность синтезированных праймеров ctx2 и ctx3 проверяли с использованием трех штаммов V. cholerae 569B, M-1298, 158 и E. coli 12226 О-55, готовили бактериальную суспензию возбудителей с конечной концентрацией 1·103 – 1·101 м.к./мл. ДНК выделяли методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинизотиоцианата.

Результаты и вывод

Результаты и вывод. Показана возможность оптимизации производства генодиагностических препаратов путем увеличения выхода олигонуклеотидов при фосфорамидитном синтезе за счет использования в качестве деблокирующего раствора 3 % дихлоруксусной кислоты в дихлорметане и окислителя – 0,1 М раствор йода в уксусной кислоте и пиридине в соотношении 1:9. Применение таких реагентов увеличивает выход конечного продукта (праймеров) на 6 и 95 % соответственно. Использование усовершенствованной технологии синтеза позволит снизить затраты на дорогостоящие импортные реагенты и повысить количество выпускаемых генодиагностических препаратов для детекции особо опасных патогенов.

Objective of the study is to investigate the impact of activator, oxidize, and unblocking solution on the quantitative yield of oligonucleotides during manufacturing of the test-system for Vibrio cholerae (ctxA+) DNA detection “GenChol”, using polymerase chain reaction.

Materials and methods

Materials and methods. The subject of the study is ctx2 and ctx3 primers, incorporated in the test-system “GenChol”. Utilized have been experimental formulations of solutions for unblocking, activator, and oxidizer and “standard” solutions, recommended by the manufacturer “BioSet” Ltd. Specific activity of the synthesized primers ctx2 and ctx3 has been evaluated on three different strains: V. cholerae 569B, M-1298, 158 and E. coli 12226 O-55. Bacterial suspension from the pathogen with final concentration of 1·103 – 1·101 m.c./ml has been produced. The DNA has been isolated applying nucleo-sorption in presence of guanidinium isothiocyanate.

Results and conclusions

Results and conclusions. Demonstrated is the possibility of optimization of diagnostic preparation production via increment of oligonucleotide yield in the process of phosphoramide synthesis, due to application of 3% dichloroacetic acid in dichloromethane as unblocking solution and oxidizer – 0.1 M iodine in athetic acid and pyridine in the ratio of 1:9. Utilization of such reagents increases the yield of the end product (primers) by 6 and 95 %, respectively. Enhanced technology for oligonucleotide synthesis will provide for the reduction of costs, associated with expensive imported reagents and the raise in the numbers of gene-diagnostic preparations for the detection of particularly dangerous pathogens.

синтез олигонуклеотидовдеблокированиеактивацияокислениеoligonucleotide synthesisunblockingactivationoxidationReferencesА ралов А. В., Чахмахчева О. Г. Защитные группы в химическом синтезе олигорибонуклеотидов. Биоорг. химия. 2013; 39(1):3–25. DOI: 10.7868/S0132342313010028.Aralov A.B., Chakhmakhcheva O.G. [Protective groups in chemical oligoribonucleotide cynthesis]. Bioorg. Khimiya. 2013; 39(1): 3–25. DOI: 10.7868/S0132342313010028.Г айдышев И. Анализ и обработка данных: специальный справочник. Санкт-Петербург: Питер; 2001. 752 с.Gaidyshev I. [Data Analysis and Processing: Specialized Reference-Book]. Saint Petersburg: “Piter”; 2001. 752 p.Beucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites – A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 1981; 22(20):1859–62. DOI: 10.1016/S0040-4039(01)90461-7.Beucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites – A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 1981; 22(20):1859–62. DOI: 10.1016/S0040-4039(01)90461-7.Ellington A., Pollard Jr. J.D. Current Protocols in Molecular Biology. Unit 2.11 Synthesis and Purification of Oligonucleotides. 1998. P. 2.11.1–2.11.25. DOI: 10.1002/0471142727.mb0211s42.Ellington A., Pollard Jr. J.D. Current Protocols in Molecular Biology. Unit 2.11 Synthesis and Purification of Oligonucleotides. 1998. P. 2.11.1–2 .11.25. DOI: 10.1002/0471142727.mb0211s42.Ferretti L., Karnik S.S., Khorana H.G., Nassal M., Oprian D.D. Total synthesis of a gene for bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83:599–603. DOI: 10.1073/pnas.83.3.599.Ferretti L., Karnik S.S., Khorana H.G., Nassal M., Oprian D.D. Total synthesis of a gene for bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83:599–603. DOI: 10.1073/pnas.83.3.599.Kaplan B.E., Itakura K. 2-DNA Synthesis on Solid Supports and Automation. In: Synthesis and Applications of DNA and RNA. Academic Press; 1987. P. 9–45. DOI: 10.1016/B978-0-12-514030- 0.50007-4.Kaplan B.E., Itakura K. 2-DNA Synthesis on Solid Supports and Automation. In: Synthesis and Applications of DNA and RNA. Academic Press; 1987. P. 9–45. DOI: 10.1016/B978-0-12-514030-0.50007-4.Song F., Krull U.J. Selectivity of hybridization controlled by the density of solid phase synthesized DNA probes on glass substrates. In: Optical waveguide sensing and imaging. Springer Science and Business Media; 2008. P. 195–210. DOI: 10.1007/978-1-4020- 6952-9_8.Song F., Krull U.J. Selectivity of hybridization controlled by the density of solid phase synthesized DNA probes on glass substrates. In: Optical waveguide sensing and imaging. Springer Science and Business Media; 2008. P. 195–210. DOI: 10.1007/978-1-4020-6952-9_8.Wang C., Trau D. A portable generic DNA bioassay system based on in situ oligonucleotide synthesis and hybridization detection. Biosens. Bioelectron. 2011; 26(5):2436–41. DOI: 10.1016/j.bios.2010.10.028.Wang C., Trau D. A portable generic DNA bioassay system based on in situ oligonucleotide synthesis and hybridization detection. Biosens. Bioelectron. 2011; 26(5):2436–41. DOI: 10.1016/j.bios.2010.10.028.White H.A. Manual Oligonucleotide Synthesis Using the Phosphoramidite Method. New Nucleic Acid Techniques. Methods Mol. Biol. 1988; 4:193–213. DOI: 10.1385/0-89603-127-6:193.White H.A. Manual Oligonucleotide Synthesis Using the Phosphoramidite Method. New Nucleic Acid Techniques. Methods Mol. Biol. 1988; 4:193–213. DOI: 10.1385/0-89603-127-6:193.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.