microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-4-56-59microbe-348Research ArticleМИКРОБИОЛОГИЯMICROBIOLOGYРазработка мультиплексной тест-системы для обнаружения и дифференциации Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei методом ПЦР в режиме реального времениDevelopment of Real-Time Multiplex PCR Assay for the Detection and Differentiation of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomalleiЛемасоваЛ. В.LemasovaL. V.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131

vari2@sprint-v.com.ruТкаченкоГ. А.TkachenkoG. A.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131

СавченкоС. С.SavchenkoS. S.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131

БондареваО. С.BondarevaO. S.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131

АнтоновВ. А.AntonovV. A.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», ВолгоградРоссияVolgograd Research Anti-Plague Institute, VolgogradRussian Federation201620122016045659Copyright © Лемасова Л.В., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Бондарева О.С., Антонов В.А., 20162016Лемасова Л.В., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Бондарева О.С., Антонов В.А.Lemasova L.V., Tkachenko G.A., Savchenko S.S., Bondareva O.S., Antonov V.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/348

Цель. Разработать мультиплексную тест-систему для выявления и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, обладающую высокой чувствительностью и специфичностью. Материалы и методы. В работе использовано 104 штамма микроорганизмов, из них: 56 штаммов В. pseudomallei, 14 – B. mallei и 34 – гетерологичных видов микроорганизмов. Для определения аналитической чувствительности реакции амплификации исследовали серии 10-кратных разведений бактериальных взвесей B. pseudomallei и B. mallei в концентрации от 1·109 м.к./мл до 1·102 м.к./мл. Результаты и выводы. Сконструирована мультиплексная ПЦР тест-система, которая включает две пары праймеров и флуоресцентно-меченные зонды, обеспечивающие одновременное обнаружение и дифференциацию двух близкородственных видов патогенных буркхольдерий. В качестве ДНК-мишеней выбраны видоспецифичный для возбудителя сапа B. mallei фрагмент гена fliР, который кодирует белок биосинтеза флагеллина, а для B. pseudomallei видоспецифичный участок гена, кодирующий белок gp68. Проверка при исследовании штаммов патогенных буркхольдерий, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов показала 100 % специфичность разработанной амплификационной тест-системы. Аналитическая чувствительность сконструированной мультиплексной ПЦР тест-системы для выявления возбудителя сапа составила 1·103 м.к./мл, а для возбудителя мелиоидоза – 1·104 м.к./мл. 

Objective of the study was to develop a real-time multiplex PCR assay for the detection and differentiation of B. mallei and B. pseudomallei, characterized by high sensitivity and specificity. Materials and Methods. The primers and probes were designed to detect the species-specific sequence of the fliР gene of B. mallei and gp68 gene of B. pseudomallei, respectively. Species specificity was tested with a panel of 56 B. pseudomallei strains, 14 B. mallei strains and 34 strains of closely or distantly related species. To define the analytical sensitivity of the assay, the serially diluted bacterial suspension at concentrations of 109 –102 cells /ml was used. Conclusions. The multiplex PCR assay with two primer pairs and fluorescently-labeled probes, allowing for simultaneous detection and differentiation between B. mallei and B. pseudomallei was designed. Species-specific for glanders agent, B. mallei, fragment of fliP gene, which encodes protein of flagellin biosynthesis, and species-specific gene region of B. pseudomallei, encoding gp68 protein, were identified as DNA targets. Testing of Burkholderia and non-Burkholderia bacterial species revealed 100 % specificity of the amplification assay. The minimum detection limit of the designed multiplex PCR test-system was 1·103 cells/ml for B. mallei, and 1·104 cells/ml for B. pseudomallei. 

сапмелиоидозтест-системаПЦР в режиме реального времениBurkholderia malleiBurkholderia pseudomalleiglandersmelioidosisPCR assayreal-time PCRBurkholderia malleiBurkholderia pseudomalleiReferencesПрохватилова Е.В., Антонов В.А., Викторов Д.В., Илюхин В.И., Храпова Н.П., Ткаченко Г.А., Захарова И.Б., Плеханова Н.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Замарина Т.В., Корсакова И.И., Савченко С.С., Бондарева О.С., Батурин А.А., Лемасова Л.В., Тетерятникова Н.Н., Белицкая Л.И. Оценка эффективности применения наборов реагентов для обнаружения возбудителя мелиоидоза при проведении внутреннего контроля качества лабораторных исследований в референс-центре по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза. Дальневосточный журн. инф. патологии. 2014; 25(25):128–32.Prokhvatilova E.V., Antonov V.A., Viktorov D.V., Ilyukhin V.I., Khrapova N.P., Tkachenko G.A., Zakharova I.B., Plekhanova N.G., Novitskaya I.V., Kulakov M.Ya., Zamarina T.V., Korsakova I.I., Savchenko S.S., Bondareva O.S., Baturin A.A., Lemasova L.V., Teteryatnikova N.N., Belitskaya L.I. [Assessment of efficiency of applying the reagent panel for the detection of melioidosis agent for the purposes of internal quality control of laboratory tests at the Reference Center for monitoring over glanders and melioidosis agents]. Dal’nevostoch. Zh. Infek. Patol. 2014; 25(25):128–32.Brilhante R.S., Bandeira T.J., Cordeiro R.A., Grangeiro T.B., Lima R.A., Ribeiro J.F., Castelo-Branco D.S., Rodrigues J.L., Coelho I.C., Magalhães F.G., Rocha M.F., Sidrim J.J. Clinicalepidemiological features of 13 cases of melioidosis in Brazil. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(10):3349–52. DOI: 10.1128/JCM.01577-12.Brilhante R.S., Bandeira T.J., Cordeiro R.A., Grangeiro T.B., Lima R.A., Ribeiro J.F., Castelo-Branco D.S., Rodrigues J.L., Coelho I.C., Magalhães F.G., Rocha M.F., Sidrim J.J. Clinical-epidemiological features of 13 cases of melioidosis in Brazil. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(10):3349–52. DOI: 10.1128/JCM.01577-12.Currie B.J., Dance D.A., Cheng A.C. The global distribution of Burkholderia pseudomallei and melioidosis: an update. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 Suppl 1:S1–4. DOI: 10.1016/S0035- 9203(08)70002-6.Currie B.J., Dance D.A., Cheng A.C. The global distribution of Burkholderia pseudomallei and melioidosis: an update. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 Suppl 1:S1–4. DOI: 10.1016/S0035-9203(08)70002-6.Chen Y.S., Lin H.H., Mu J.J., Chiang C.S., Chen C.H., Buu L.M., Lin Y.E., Chen Y.L. Distribution of melioidosis cases and vi- able Burkholderia pseudomallei in soil: evidence for emerging me- lioidosis in Taiwan. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4):1432–4. DOI: 10.1128/JCM.01720-09 48.Chen Y.S., Lin H.H., Mu J.J., Chiang C.S., Chen C.H., Buu L.M., Lin Y.E., Chen Y.L. Distribution of melioidosis cases and viable Burkholderia pseudomallei in soil: evidence for emerging melioidosis in Taiwan. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4):1432–4. DOI: 10.1128/JCM.01720-09 48.Jamkhandi D.M., Alex R., George K. Melioidosis: a report of two cases. Natl. Med. J. India. 2014; 27(4):202–3.Jamkhandi D.M., Alex R., George K. Melioidosis: a report of two cases. Natl. Med. J. India. 2014; 27(4):202–3.Rainbow L., Hart C.A., Winstanley G. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailan- densis and B. mallei. J. Med. Microbiol. 2002; 51(5):374–84.Rainbow L., Hart C.A., Winstanley G. Distribution of type III secre- tion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mal- lei. J. Med. Microbiol. 2002; 51(5):374–84.Sonthayanon P., Krasao P., Wuthiekanun V., Panyim S., Tungpradabkul S. A simple method to detect and differentiate Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis using spe- cific flagellin gene primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3):217–22.Sonthayanon P., Krasao P., Wuthiekanun V., Panyim S., Tungpradabkul S. A simple method to detect and differentiate Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis using specific flagellin gene primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3):217–22.Tomaso H., Pitt T.L., Landt O., Dahouk S.A., Scholz H.C., Reisinger E.C., Sprague L.D., Rathmann I., Neubauer H. Rapid presumptive identification of Burkholderia pseudomallei with real￾time PCR assays using fluorescent hybridization probes. Mol. Cell. Probes. 2005; 19(1):9–20.Tomaso H., Pitt T.L., Landt O., Dahouk S.A., Scholz H.C., Reisinger E.C., Sprague L.D., Rathmann I., Neubauer H. Rapid presumptive identifica- tion of Burkholderia pseudomallei with real-time PCR assays using fluores- cent hybridization probes. Mol. Cell. Probes. 2005; 19(1):9–20.Whitlock G.C., Estes D.M., Torres A.G. Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol. Lett. 2007; 277(2):115–22.Whitlock G.C., Estes D.M., Torres A.G. Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol. Lett. 2007; 277(2):115–22.Winstanley C., Hart C. A. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara– phenotypes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(2):883–5.Winstanley C., Hart C. A. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara– phenotypes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(2):883–5.Varma-Basil M., E-Hajj H, Marras S.A., Hazbón M.H., Mann J.M., Connell N.D., Kramer F.R., Alland D. Molecular bea- cons for multiplex detection of four bacterial bioterrorism agents. Clin. Chem. 2004; 50(6):1060–2.Varma-Basil M., E-Hajj H, Marras S.A., Hazbón M.H., Mann J.M., Connell N.D., Kramer F.R., Alland D. Molecular beacons for multiplex detec- tion of four bacterial bioterrorism agents. Clin. Chem. 2004; 50(6):1060–2.Yang S. Melioidosis research in China. Acta Trop. 2000; 77(2):157–65.Yang S. Melioidosis research in China. Acta Trop. 2000; 77(2):157–65.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.