microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2016-4-64-68microbe-350Research ArticleМИКРОБИОЛОГИЯMICROBIOLOGYИммуночипы для одновременного обнаружения пяти ботулотоксинов методом фосфоресцентного анализа (ФОСФАН)Microarray Immunoassay Tests for Simultaneous Detection of Five Botulinum Toxins by Phosphorescence Analysis (PHOSPHAN)НикитинаА. В.NikitinaA. V.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

an-na-nikitina@ya.ruПомеловаВ. Г.PomelovaV. G.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

БыченковаТ. А.BychenkovaT. A.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

ПарамоновД. В.ParamonovD. V.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

КострюковаТ. С.KostryukovaT. S.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

ОсинН. С.OsinN. S.

125424, Москва, Волоколамское шoccе, 75/1

75/1, Volokolamskoe Highway, Moscow, 125424

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения», МоскваРоссияState Research Institute of Biological Instrument Engineering, MoscowRussian FederationЗАО «Иммуноскрин», МоскваРоссияCJSC “Immunoscreen”, MoscowRussian Federation201620122016046468Copyright © Никитина А.В., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Парамонов Д.В., Кострюкова Т.С., Осин Н.С., 20162016Никитина А.В., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Парамонов Д.В., Кострюкова Т.С., Осин Н.С.Nikitina A.V., Pomelova V.G., Bychenkova T.A., Paramonov D.V., Kostryukova T.S., Osin N.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/350

Цель работы. Разработать и сравнить по чувствительности тесты для одновременного обнаружения ботулотоксинов A, B, C, E, F методом мультиплексного фосфоресцентного анализа (ФОСФАН) с применением стандартной (на основе Pt копропорфирина) и модифицированной (на основе биоспецифичных наночастиц) систем регистрации фосфоресцентного сигнала. Материалы и методы. Иммуноанализ по технологии ФОСФАН выполняли в лунках стандартного 96-луночного микропланшета. На дне каждой лунки были напечатаны в виде микропятен моноспецифические антитела и поливалентный иммуноглобулин. Диапазон анализируемых концентраций анатоксинов – от 100 до 0,005 нг/мл. Для проявления реакции использовали смесь конъюгированных с биотином моноспецифических и поливалентного иммуноглобулинов и детекторные системы на основе конъюгатов стрептавидина с Pt копропорфирином или полистироловыми наночастицами, содержащими хелат европия. Люминесценцию обоих метчиков регистрировали на биочип-анализаторе в режиме временного разрешения. Порог детекции определяли как минимальную концентрацию анатоксина, при которой отношение P/N ≥ 2, а число таких проб (в серии из 10–30 экспериментов) не менее 50 %. Результаты и выводы. Разработанные иммуночипы обеспечивали группоспецифическое обнаружение пяти ботулотоксинов с возможностью типоспеци- фической идентификации ботулотоксинов А, В и Е. Перекрестные реакции между ботулотоксинами не выявлены. Применение фосфоресцентных наночастиц позволило повысить чувствительность детекции примерно на порядок до 10 пг/мл. Разработанные мультиплексные тесты можно рекомендовать для специфической индикации ботулотоксинов в клинических образцах, пробах из объектов окружающей среды или пищевых продуктов. 

Combination of multiplex microarray immunoassay tests and luminescent nanoparticle tags is considered as a promising approach to the development of highly sensitive, specific, and rapid methods of causative agent detection. Objective of this study was to develop and compare the sensitivity of the tests for simultaneous detection of five botulinic toxins (A,B,C,E,F) applying multiplex phosphorescence analysis (PHOSPHAN) using standard (Pt coproporphyrin tag-based) and modified (europium containing nanoparticles) systems of phosphorescent signal registration. Materials and methods. PHOSPHAN assay was performed in standard 96 well microplate. The toxoids added to the wells interacted with monospecific and polyvalent immunoglobulins printed as tiny spots on the bottom of each well, and with a mixture of the same antibodies conjugated to biotin. Analyzed anatoxin concentration range – 0.005 to 100 ng/ml. The reaction was manifested by streptavidin conjugated to either Pt coproporphyrin, or the luminescent nanoparticles. The luminescence of both tags was recorded in time-resolved mode by Biochip Analyzer. The limit of detection corresponded to a minimum toxoid concentration, at which the P/N ratio was equal or exceeded 2, while the number of such samples (in a series of 10-30 experiments) was no less than 50%. Results and conclusions. Both multiplex tests provided for simultaneous group-specific detection of five botulinum toxins with the option of type-specific (A, B, E) identification. No cross-reactivity was revealed. The use of phosphorescent nanoparticles allowed for the increase in detection sensitivity by an order of magnitude, up to 10 pg/ml. The tests developed could be recommended for specific detection and identification of botulinum toxins in clinical, environmental, and food samples. 

ботулотоксины типов ABCEFиммуночипымультиплексный фосфоресцентный анализ (ФОСФАН)биоспецифичные наночастицыPt копропорфиринхелат Eubotulinum toxin types ABCEFmicroarray immunoassay testsmultiplex phosphorescence analysis (PHOSPHAN)biospecific nanoparticlesPt coproporphyrinEu chelateReferencesОсин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С., Быченкова Т.А., Бекман Н.И., Шарафудинова Т.Ю., Аслиян С.К., Ивановская Н.П., Ларичева С.Ю., Канаева Т.А. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики. Вестник РАМН. 2007; 12:3–10.Osin N.S., Pomelova V.G., Sokolov A.S., Bychenkova T.A., Bekman N.I. Sharafudinova T.Yu., Asliyan S.K., Ivanovskaya N.P., Laricheva S.Yu., Kanaeva T.A. [Phosphorescent microassay as a basisi for novel technological platform for molecular diagnostics]. RAMS Bulletin. 2007; 12:3–10.Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Осин Н.С. Иммуночип на основе микропланшетной технологии ФОСФАН для определе- ния иммуноглобулинов G к вирусам Западного Нила, Крымской- Конго геморрагической лихорадки и клещевого энцефалита. Пробл. особо опасных инф. 2009; 3(101):54–8.Pomelova V.G., Bychenkova T.A., Ossin N.S. [PHOSPHAN mi- croplate technology-based microarray for detection of IgG antibodies against West Nile, Crimean-Congo hemorrhagic fever and tick-borne encephalitis viruses]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; 3(101):54–8.Arnon S.S., Schechter R., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D. Hauer J., Layton M., Lillibridge S., Osterholm M.T., O'Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Swerdlow D.L., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(8):059–70.Arnon S.S., Schechter R., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D. Hauer J., Layton M., Lillibridge S., Osterholm M.T., O’Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Swerdlow D.L., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(8):059–70.Capek P., Dickerson T.J. Sensing the Deadliest Toxin: Technologies for Botulinum Neurotoxin Detection. Toxins. 2010; 2:24–53; DOI: 10.3390/toxins2010024.Capek P., Dickerson T.J. Sensing the Deadliest Toxin: Technologies for Botulinum Neurotoxin Detection. Toxins. 2010; 2:24–53; DOI: 10.3390/ toxins2010024.Doellgast G. J., Triscott M. X., Beard G. A., Bottoms J. D., Cheng T., Roh B. H., Roman M. G., Hall P. A., Brown Е. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum neurotoxins A, B, and E using signal amplification via enzyme-linked coagulation assay. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:2402–9.Doellgast G. J., Triscott M. X., Beard G. A., Bottoms J. D., Cheng T., Roh B. H., Roman M. G., Hall P. A., Brown Е. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum neurotoxins A, B, and E using signal amplification via enzyme-linked coagulation assay. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:2402–9.Ferreira J. L., Eliasberg S. J., Edmonds P., Harrison M. A. Comparison of the mouse bioassay and enzyme-linked immunosor- bent assay procedures for the detection of type A botulinal toxin in food. J. Food Prot. 2004; 67(1):203–6.Ferreira J. L., Eliasberg S. J., Edmonds P., Harrison M. A. Comparison of the mouse bioassay and enzyme-linked immunosorbent assay procedures for the detection of type A botulinal toxin in food. J. Food Prot. 2004; 67(1):203–6.Jaras K., Tajudin A.A., Ressine A., Soukka T., Marko-Varga G., Bjartell A., Malm J., Laurell T., Lilja H. Europium nanoparticles for signal enhancement of antibody microarrays on nanoporous sili- con. J. Proteome Res. 2008; 7:1308–14; DOI: 10.1021/pr700591j.Jaras K., Tajudin A.A., Ressine A., Soukka T., Marko-Varga G., Bjartell A., Malm J., Laurell T., Lilja H. Europium nanoparticles for signal enhancement of antibody microarrays on nanoporous silicon. J. Proteome Res. 2008; 7:1308–14; DOI: 10.1021/pr700591j.Jenko K.L., Zhang Y., Kostenko Y., Fan Y., Garcia-Rodriguez C., Lou J., Marks J.D., Varnum S.M. Development of an ELISA mi- croarray assay for the sensitive and simultaneous detection of ten biodefense toxins. Analyst. 2014; 139:5093–102; DOI: 10.1039/ c4an01270d.Jenko K.L., Zhang Y., Kostenko Y., Fan Y., Garcia-Rodriguez C., Lou J., Marks J.D., Varnum S.M. Development of an ELISA microarray assay for the sensitive and simultaneous detection of ten biodefense toxins. Analyst. 2014; 139:5093–102; DOI: 10.1039/c4an01270d.Osin N.S., Pomelova V.G. Microarray immunophospho- rescence technology for the detection of infectious pathogens. In: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Frontiers in Research. Humana Press; 2008. P. 233–40. DOI: 10.1007/978-1- 59745-569-5_25.Osin N.S., Pomelova V.G. Microarray immunophosphorescence technology for the detection of infectious pathogens. In: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Frontiers in Research. Humana Press; 2008. P. 233–40. DOI: 10.1007/978-1-59745-569-5_25.Scarlatos A., Welt B. A., Cooper B.Y., Archer D., DeMarse T., Chau K.V. Methods for detecting botulinum toxin with appli- cability to screening foods against biological terrorist attacks. J. of Food Science. 2005; 70(8):121–30; DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005. tb11525.x.Scarlatos A., Welt B. A., Cooper B.Y., Archer D., DeMarse T., Chau K.V. Methods for detecting botulinum toxin with applicability to screening foods against biological terrorist attacks. J. of Food Science. 2005; 70(8):121–30; DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005.tb11525.x.Schiavo G., Matteoli M., Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000; 80:717–66.Schiavo G., Matteoli M., Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000; 80:717–66.Sharma S.K., Ferreira J.L., Eblen B.S., Whiting R.C. Detection of type A, B, E, and F Clostridium botulinum neurotoxins in foods by using an amplified enzyme-linked immunosorbent assay with digoxigenin-labeled antibodies. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1231–8. DOI: 10.1128/AEM.72.2.1231-1238.2006.Sharma S.K., Ferreira J.L., Eblen B.S., Whiting R.C. Detection of type A, B, E, and F Clostridium botulinum neurotoxins in foods by using an amplified enzyme-linked immunosorbent assay with digoxigenin-labeled antibodies. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1231–8. DOI: 10.1128/ AEM.72.2.1231-1238.2006.Wictome M. W., Newton K., Jameson K., Hallis B., Dunnigan P., Mackay E., Clarke S., Taylor R., Gaze J., Foster K., Shone C. C. Development of an in vitro bioassay for Clostridium botulinum type B neurotoxin in foods that is more sensitive than the mouse bioassay. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(9):3787–92.Wictome M. W., Newton K., Jameson K., Hallis B., Dunnigan P., Mackay E., Clarke S., Taylor R., Gaze J., Foster K., Shone C. C. Development of an in vitro bioassay for Clostridium botulinum type B neurotoxin in foods that is more sensitive than the mouse bioassay. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(9):3787–92.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.