microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2017-3-105-109microbe-422Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGY, IMMUNOLOGYОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВOPTIMIZATION OF THE TECHNOLOGICAL SCHEME FOR THE PRODUCTION OF PREPARATIONS FOR GENE DIAGNOSTICS OF PARTICULARLY DANGEROUS INFECTIOUS DISEASES USING POLYMERASE CHAIN REACTION WITH HYBRIDIZATION-FLUORESCENT REGISTRATION OF RESULTSСтепановА. В.StepanovA. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

rusrapi@microbe.ruОсинаН. А.OsinaN. A.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

МайоровН. В.MayorovN. V.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

46, Universitetskaya St., Saratov, 410005

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»РоссияRussian Research AntiPlague Institute “Microbe”Russian Federation20172009201703105109Copyright © Степанов А.В., Осина Н.А., Майоров Н.В., 20172017Степанов А.В., Осина Н.А., Майоров Н.В.Stepanov A.V., Osina N.A., Mayorov N.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/422Цель

Цель: оптимизация технологической схемы получения препарата для генной диагностики чумы с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, связанная с подбором условий синтеза и метода очистки входящих в состав набора олигонуклеотидных зондов, несущих метки флуорофора (6-карбоксифлуоресцеин) и гасителя флуоресценции (Black Hole Quencher-1), оценка их качества и внедрения новой технологической линии в производство.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектом для исследования являлся набор реагентов «Ген Yersinia pestis идентификация–РГФ» и входящие в его состав праймеры и зонд, обеспечивающие амплификацию hmsH гена. Синтез праймеров и зондов осуществляли в восьмиканальном синтезаторе ДНК ASM-800 (Биоссет, Россия) твердофазным фосфитамидным методом. Для проведения исследований использовали очистку полученных зондов либо с помощью электрофореза в 20 % полиакриламидном геле размером 20×20 или 8×10 см с последующей очисткой на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме на системе OPS-201 и вручную, либо только с RP- картриджами вручную, либо методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специфическую активность полученных зондов проверяли в полимеразной цепной реакции с использованием ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Yersinia pestis C-624 с концентрациями 1·103 – 1·106 м.к./мл.

Результаты и выводы

Результаты и выводы. Оптимизирована технология синтеза и подобран метод очистки олигонуклеотидных зондов, несущих флуорофор-6-карбоксифлуоресцеин и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher-1. Показана целесообразность использования для очистки таких олигонуклеотидов, либо комплекса ВЭЖХ, либо электрофореза в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и последующей хроматографией на RP-картриджах в ручном режиме. Внедрение оптимизированной технологической схемы при производстве препаратов для генной индикации идентификации особо опасных патогенов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией позволит сократить сроки их изготовления на 50 % и снизить себестоимость на 66 %. 

Objective of the study was to optimize technological scheme for the production of preparation for gene diagnostics of plague with hybridization-fluorescent registration (HFR) of results, which is associated with the assessment and selection of synthesis conditions and method of oligonucleotide probe purification included into the kit and carrying fluorophore (6-carboxyfluorescein) and quencher (Black Hole Quencher-1) tags, as well as to evaluate their properties and implement this new technological line into manufacturing.

Materials and methods

Materials and methods. The object of investigation was the reagent panel “Gene Yersinia pestis Identification-HFR” and its constituent elements, probes and primers, providing for hmsH gene amplification. Synthesis of the primers and probes was carried out in 8-well DNA synthesizer ASM-800 (Bioset, Russia), using solid phosphite amid method. For the experiments the probes obtained were purified either by means of electrophoresis in 20 % polyacrylamide gel (size 20×20) or (size 8×10) with further purification through RP-cartridges in semi-automated mode in OPS-201 system and manually, or on RP-cartridges only in manual mode; or applying highperformance liquid chromatography (HPLC). Specific activity of the produced probes was tested by polymerase chain reaction using the DNA isolated from bacterial suspensions of Yersinia pestis C-624 strain, in concentrations up to 1·103 – 1·106 mc/ml.

Results and conclusions

Results and conclusions. Optimized has been synthesis technology; selected has been the method for oligonucleotide probe purification, carrying phluorophore-6-carboxyphluorescin and Black Hole Quencher-1. Demonstrated is viability of applying the stated oligonucleotides or HPLC, or electrophoresis in 20 % polyacrylamide gel with 7 M urea and further purification through RP-cartridges in manual mode for purification purposes. Introduction of the optimized technological scheme in manufacturing of preparations for gene indication and identification of particularly dangerous pathogens with hybridization-fluorescent detection will allow for the reduction of lead time by 50 % and original cost – by 66 %. 

Black Hole Quencher–1генодиагностические препаратыдетекция6-карбоксифлуоресцеинпатогенные биологические агентысинтез зондовBlack Hole Quencher-1gene diagnostic preparationsdetection6-carboxyfluoresceinpathogenic biological agentsprobe synthesisReferencesКуклев В.Е., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля. Патент РФ № 2473701. 2013.Бюлл. 3 от 27.01.2013.Kuklev V.E., Osina N.A., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V. [The kit and methodology for rapid identification of plague microbe with simultaneous differentiation between virulent and avirulent Y. pestis strains, and specification of their plasmid profile]. RF Patent No 2473701. 2013. Bulletin N 3 dated January 27, 2013.Олиго Кальк: Программа для расчета свойств олигонуклеотидов (праймеров). Интернет-портал биологического факультета Белорусского Государственного Университета. http:// bio.bsu.by/molbiol/index.php?pg=oligocalc (дата обращения 24.04.2017).[Oligo Calc: software for calculation of oligonucleotide properties (primers)]. Internet-portal of the Biology Department, Belorussian State University. (cited 24 Apr 2017). Available from: http://bio.bsu.by/molbiol/index.php?pg=oligocalc.Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. М.: Финансы и статистика; 1982. 344 с.Pollard G. [Reference Book on Statistical Computational Methods]. M.; 1982. 344 p.Ke G., Zhu Z., Wang W., Zou Y., Guan Z., Jia S., Zhang H., Wu X., Yang C.J. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6(17):15329–34. DOI: 10.1021/am503818n.Ke G., Zhu Z., Wang W., Zou Y., Guan Z., Jia S., Zhang H., Wu X., Yang C.J. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6(17):15329– 34. DOI: 10.1021/am503818n.Mullah B., Livak K., Andrus A., Kenney P. Efficient synthesis of double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay. Nucleic Acids Res. 1998; 26(4):1026–31. DOI: 10.1093/nar/26.4.1026.Mullah B., Livak K., Andrus A., Kenney P. Efficient synthesis of double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay. Nucleic Acids Res. 1998; 26(4):1026–31. DOI: 10.1093/nar/26.4.1026.Tatarinova O.N., Lukyanova T.N., Zaitseva M.A., Veremeev K.Y., Karpov V.A., Chuvilin A.N., Petrunin D.D., Pozmogova G.E. Significance of Methods for Purification of Oligodeoxyribonucleotide Probes for the Efficiency of Gene Diagnosis by Real-Time PCR. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(3):312–6. DOI: 10.1007/s10517-008-0078-6.Tatarinova O.N., Lukyanova T.N., Zaitseva M.A., Veremeev K.Y., Karpov V.A., Chuvilin A.N., Petrunin D.D., Pozmogova G.E. Significance of Methods for Purification of Oligodeoxyribonucleotide Probes for the Efficiency of Gene Diagnosis by Real-Time PCR. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(3):312–6. DOI: 10.1007/s10517-008-0078-6.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.