microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2017-4-92-96microbe-446Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESМасс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микробаMass Spectrometric Analysis of Natural and Antigen-Modified Strains of Tularemia AgentЦимбалистоваМ. В.TsimbalistovaM. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

tularemia@antiplague.ruПавловичН. В.PavlovichN. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

АроноваН. В.AronovaN. V.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

ЧайкаИ. А.ChaikaI. A.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

ЧайкаС. О.ChaikaS. O.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

ВодопьяновА. С.Vodop’yanovA. S.

Российская Федерация, 344002, Ростов-на- Дону, ул. М.Горького, 117/40

117/40, M.Gor`kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»РоссияRostov-on-Don Research Anti-Plague InstituteRussian Federation201720122017049296Copyright © Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., Аронова Н.В., Чайка И.А., Чайка С.О., Водопьянов А.С., 20172017Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., Аронова Н.В., Чайка И.А., Чайка С.О., Водопьянов А.С.Tsimbalistova M.V., Pavlovich N.V., Aronova N.V., Chaika I.A., Chaika S.O., Vodop’yanov A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/446

Цель работы. Сравнительное изучение белковых профилей типичных вирулентных и изогенных авирулентных ЛПС-дефектных штаммов туляремийного микроба с помощью масс-спектрометрического анализа. Материалы и методы. В работе использовали 6 родительских вирулентных (трех основных подвидов) и 8 изогенных авирулентных штаммов Francisella tularensis, имеющих различные повреждения в структуре ЛПС. Получение спектров исследуемых культур методом MALDI-TOF MS проводили с использованием масс-спектрометра Autoflex speed III Bruker Daltonics и программного обеспечения Flex Control, идентификацию – с помощью программы Biotyper, база данных которой была расширена нами ранее внесением масс-спектров 40 типичных штаммов F. tularensis трех основных подвидов. Результаты и выводы. При оценке влияния пробоподготовки образцов на качество снимаемых спектров с помощью трех методов (экстракция матрицей, ТФУ и этиловым спиртом) показано, что наиболее эффективным является метод обработки бактерий этиловым спиртом и муравьиной кислотой.Согласно полученным данным, типичные вирулентные штаммы туляремийного микроба трех основных подвидов имеют существенные различия в мажорных пиках, что позволяет использовать MALDI-TOF MS для проведения подвидовой дифференциации. Вместе с тем при сравнительном изучении белковых спектров вирулентных и авирулентных штаммов F. tularensis принципиальных отличий не выявлено. При этом нам удалось обнаружить единичные масс-спектры m/z 4673, 6929, характерные для вирулентных, и m/z 7256 – для авирулентных штаммов.Таким образом, метод MALDI-TOF MS дает возможность достоверно определять подвидовую принадлежность штамма, однако не позволяет проводить дифференциацию штаммов разной степени вирулентности. Результаты выявили, что MALDI-TOF может быть полезным как при идентификации типичных, так и антиген-измененных ЛПС-дефектных штаммов F. tularensis.

Objective. Comparative study of the protein profiles of typical virulent strains and their isogenic avirulent LPS-defective mutants of Francisella tularensis using mass spectrometric analysis. Materials and methods. Six typical virulent strains of F. tularensis of three main subspecies and eight isogenic avirulent variants which have different lesions in LPS structure were used in this investigation.Protein spectra were obtained by MALDI-TOF MS using mass spectrometer Autoflex speed III Bruker Daltonics and Flex Control software of Biotyper. Earlier we expanded the database by introduction of the mass spectra of 40 typical F. tularensis strains of the three main subspecies. Results and conclusions. It was shown that the high quality spectrograms were obtained by means of the extraction of bacteria with ethanol supplemented with formic acid, as compared with two other methods (extraction matrix or TFA).According to the data received, the typical virulent strains of tularemia agent of the three main subspecies have significant differences in the major peaks of protein profiles. This suggests that MALDI-TOF MS can be used for the subspecies differentiation of F. tularensis.However, a comparative study of the protein spectra of virulent and isogenic avirulent F. tularensis strains of the same subspecies did not detect any essential differences. We were able to identify only two individual peaks (m/z 4673, 6929) which were characteristic of all virulent strains and one peak (m/z 7256) – of all avirulent strains. Thus, MALDI-TOF MS allows for reliable determination of the subspecies affiliation of F. tularensis strains but does not allow for evaluation of the strains` virulence. The results indicate that MALDI-TOF MS is a useful method for identification of typical and antigen-modified LPS-defective F. tularensis strains.

F. tularensis трех основных подвидовавирулентные ЛПС-дефектные мутантыMALDI-TOFвирулентностьF. tularensis of three main subspeciesLPS-defective avirulent mutantsMALDI-TOFvirulenceReferencesАфанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MALDITOF масс-спектрометрический анализ для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2015; 33(2):3–8. DOI: 10.3103/S0891416815020020.Afanas’ev M., Mironova L., Balakhonov S. [MALDI-TOF massspectrometric analysis for identification of plague agent, cholera and tularemia agents]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2015; 33(2):3–8. DOI: 10.3103/S0891416815020020.Мещерякова И.С., Добровольский А.А., Демидова Т.Н., Кормилицына М.И., Михайлова Т.В. Трансмиссивная эпидемическая вспышка туляремии в г. Ханты-Мансийске в 2013 году. Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. 2014; 5(78):14–20.Meshcheryakova I.S., Dobrovol’sky A.A., Demidova T.N., Kormilitsyna M.I., Mikhailova T.V. [Transmissible epidemic outbreak of tularemia in 2013 in Khanty-Mansiysk]. Epidemiol. Vaktsinoprof. 2014; 5(78):14–20.Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis. Антибиотики и мед. биотехнол. 1987; 32(2):133–7.Pavlovich N.V., Mishan’kin B.N. [Transparent nutrient medium for Francisella tularensis cultivation]. Antibiotiki i Med. Biotekhnol. 1987; 32(2):133–7.Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рыжкова В.В., Данилевская Г.И., Михалевич Р.В. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tularensis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993; 3:21–30.Pavlovich N.V., Mishan’kin B.N., Shimanyuk N.Ya., RyzhkovaV.V., Danilevskaya G.I., Mikhalevich R.V. [Characteristics of biological properties of acapsular Francisella tularensis variants]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993; 3:21–30.Павлович Н.В., Тынянова В.И. Возможные механизмы реализации токсического потенциала липополисахаридов патогенных бактерий. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2005; 2:9–12.Pavlovich N.V., Tynyanova V.I. [Possible mechanisms of toxic lipopolysaccharides potential realization of pathogenic bacteria]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2005; 2:9–12.Chambers M.C., Maclean B., Burke R., Amodei D., Ruderman D.L., Neumann S., Gatto L., Fischer B., Pratt B., Egertson J., Hoff K., Kessner D., Tasman N., Shulman N., Frewen B., Baker T.A., Brusniak M.Y., Paulse C., Creasy D., Flashner L., Kani K., Moulding C., Seymour S.L., Nuwaysir L.M., Lefebvre B., Kuhlmann F., Roark J., Rainer P., Detlev S., Hemenway T., Huhmer A., Langridge J., Connolly B., Chadick T., Holly K., Eckels J., Deutsch E.W., Moritz R.L., Katz J.E., Agus D.B., MacCoss M., Tabb D.L., Mallick P. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nat. Biotechnol. 2012; 30:918–20. DOI: 10.1038/nbt.2377.Chambers M.C., Maclean B., Burke R., Amodei D., Ruderman D.L., Neumann S., Gatto L., Fischer B., Pratt B., Egertson J., Hoff K., Kessner D., Tasman N., Shulman N., Frewen B., Baker T.A., Brusniak M.Y., Paulse C., Creasy D., Flashner L., Kani K., Moulding C., Seymour S.L., Nuwaysir L.M., Lefebvre B., Kuhlmann F., Roark J., Rainer P., Detlev S., Hemenway T., Huhmer A., Langridge J., Connolly B., Chadick T., Holly K., Eckels J., Deutsch E.W., Moritz R.L., Katz J.E., Agus D.B., MacCoss M., Tabb D.L., Mallick P. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nat. Biotechnol. 2012; 30:918–20. DOI: 10.1038/nbt.2377.Drevinek М., Dresler J., Klimentova J., Pisa L., Hubalek М. Еvaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria Lett. Appl. Microbiol. 2012; 55(1):40–4. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2012.03255.x.Drevinek М., Dresler J., Klimentova J., Pisa L., Hubalek М. Еvaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria Lett. Appl. Microbiol. 2012; 55(1):40–4. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2012.03255.x.Jiang J.J., Parker C.E., Fuller J.R., Kawula T.H., Borchers C.H. An Immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis. Anal. Clin. Acta. 2007; 605(1):70–9.Jiang J.J., Parker C.E., Fuller J.R., Kawula T.H., Borchers C.H. An Immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis. Anal. Clin. Acta. 2007; 605(1):70–9.Karatuna О., Çelebi B., Can S., Akyar I., Kiliç S. The use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in the identification of Francisella tularensis. Bosn. J. Basic Med. Sci. 2016; 16(2):132–8. DOI: org/10.17305/ bjbms.2016.894.Karatuna О., Çelebi B., Can S., Akyar I., Kiliç S. The use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in the identification of Francisella tularensis. Bosn. J. Basic Med. Sci. 2016; 16(2):132–8. DOI: org/10.17305/bjbms.2016.894.Lai X.H., Zhao L.F., Chen X.M., Ren Y. Rapid identification and characterization of Francisella by molecular biology and other techniques. Open Microbiol. J. 2016; 10(suppl. 1):64–77. DOI: 10.2174/1874285801610010064.Lai X.H., Zhao L.F., Chen X.M., Ren Y. Rapid identification and characterization of Francisella by molecular biology and other techniques. Open Microbiol. J. 2016; 10(suppl. 1):64–77. DOI: 10.2174/1874285801610010064.López-Fernández H., Santos H.M., Capelo J.L., FdezRiverola F., Glez-Peña D., Reboiro-Jato M. Mass-Up: an all-inone open software application for MALDI-TOF mass spectrometry knowledge discovery. BMC Bioinformatics. 2015; 16:318. DOI: org/10.1186/s12859-015-0752-4.López-Fernández H., Santos H.M., Capelo J.L., Fdez-Riverola F., Glez-Peña D., Reboiro-Jato M. Mass-Up: an all-in-one open software application for MALDI-TOF mass spectrometry knowledge discovery. BMC Bioinformatics. 2015; 16:318. DOI: org/10.1186/s12859-015-0752-4.McLendon M.K., Apicella M.A., Allen L-A.H. Francisella tularensis taxonomy, genetics and immunopathogenesis of potential agent of biowarfare. Annu. Rev. Microbiol. 2006; 60:167–185. DOI: 10.1146/annurev.micro.60.080805.142126.McLendon M.K., Apicella M.A., Allen L-A.H. Francisella tularensis taxonomy, genetics and immunopathogenesis of potential agent of biowarfare. Annu. Rev. Microbiol. 2006; 60:167–185. DOI: 10.1146/annurev.micro.60.080805.142126.Twine S., Vinogradov E., Lindgren H., Sjostedt A., Conlan J. Roles for wbtC, wbtI, and kdtA genes in lipopolysaccharide biosynthesis, protein glycosylation, virulence, and immunogenicity in Francisella tularensis strain SCHU S4. Pathogens. 2012; 1:12–29. DOI: 10.3390/pathogens1010012.Twine S., Vinogradov E., Lindgren H., Sjostedt A., Conlan J. Roles for wbtC, wbtI, and kdtA genes in lipopolysaccharide biosynthesis, protein glycosylation, virulence, and immunogenicity in Francisella tularensis strain SCHU S4. Pathogens. 2012; 1:12–29. DOI: 10.3390/pathogens1010012.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.