microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2011-1(107)-70-73microbe-592Research ArticleИММУНОЛОГИЯIMMUNOLOGYКонструирование кандидата в вакцинные штаммы Yersinia pestis с пониженной реактогенностьюConstruction of Candidate Yersinia pestis Vaccine Strains with Reduced ReactogenicityАгеевС. А.AgeevS. A.noemail@neicon.ruШайхутдиноваР. З.ShaikhutdinovaR. Z.noemail@neicon.ruБахтееваИ. В.BakhteevaI. V.noemail@neicon.ruТитареваГ. М.TitarevaG. M.noemail@neicon.ruКомбароваТ. И.KombarovaT. I.noemail@neicon.ruДентовскаяС. В.DentovskayaS. V.noemail@neicon.ruАнисимовА. П.AnisimovA. P.anisimov@obolensk.orgГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологииРоссияState Research Center for Applied Microbiology and BiotechnologyRussian Federation20112002201101(107)7073Copyright © Агеев С.А., Шайхутдинова Р.З., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Дентовская С.В., Анисимов А.П., 20112011Агеев С.А., Шайхутдинова Р.З., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Дентовская С.В., Анисимов А.П.Ageev S.A., Shaikhutdinova R.Z., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kombarova T.I., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/592

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих ΔlpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез, клонирование мутантной аллели ΔlpxM::cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезировал липополисахарид (ЛПС) со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-α. Степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVΔlpxM, была значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.

The technology of directed constructing of non-reverting Y. pestis ∆lpxM mutants, lacking antibiotic resistance markers was developed. It included direct site-specific mutagenesis, cloning of mutant ∆lpxM::cat allele in pCVD442 suicide vector, homologous recombination in vivo and deletion of the antibiotic resistance cassette. lpxM gene knockout mutant created on the basis of vaccine Y. pestis EV NIIEG strain lacking antibiotic resistance markers synthesized a lipopolysaccharide (LPS) with reduced ability to stimulate TNF-α production. The level of reduction of anti-inflammatory activity of the LPS synthesized by the mutant Y. pestis EV∆ lpxM strain was significantly higher in the test with human target cells in comparison with mouse model.

lpxMсайт-направленный мутагенезлипополисахаридэндотоксическая активностьYersinia pestislpxMsite-specific mutagenesislipopolysaccharideendotoxic activityYersinia pestisReferencesАшмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы; 1962, 104 c.Ashmarin I.P., Vorob’ev A.A. [Statistic Methods in Microbiological Investigations]. Leningrad: Gos. Izd. Med. Lit.; 1962. 104 p.Дентовская С.В., Шайхутдинова Р.З., Книрель Ю.А. Иванов С.А., Анисимов А.П. Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью. Мол. генет. 2006; 2:3-8.Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Knirel’ Yu. A., Ivanov S.A., Anisimov A.P. [Constructing of Gram-Negative Bacteria Vaccine Strains with Reduced Reactogenicity]. Mol. Gen. 2006; 2:3–8.Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Шайхутдинова Р.З., Кондакова А.Н., Быстрова О.В. и др. Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis. Биохимия. 2008; 73(2):237-46.Dentovskaya S.V., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Shaikhutdinova R.Z., Kondakova A.N., Bystrova O.V., Lindner B., Knirel Y.A., Anisimov A.P. [Structural Diversity and Endotoxic Activity of the Lipopolysaccharide of Yersinia pestis]. Biochemistry. 2008; 73(2):192–9.Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17(2):434-64.Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17(2):434-64.Anisimov A.P., Shaikhutdinova R.Z., Pan'kina L.N., Feodorova V.A., Savostina E.P., Bystrova O.V. et al. Effect of deletion of the lpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice. J. Med. Microbiol. 2007; 56( 4):443-53.Anisimov A.P., Shaikhutdinova R.Z., Pan'kina L.N., Feodorova V.A., Savostina E.P., Bystrova O.V. et al. Effect of deletion of the lpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice. J. Med. Microbiol. 2007; 56( 4):443-53.Datsenko K., Wanner B. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97:6641-45.Datsenko K., Wanner B. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97:6641-45.Donnenberg M.S., Kaper J.B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 1991; 29(12):4310-7.Donnenberg M.S., Kaper J.B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 1991; 29(12):4310-7.Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina E.P., Sayapina L.V., Motin V.L., Dentovskaya S.V. et al. A Yersinia pestis lpxM-mutant live vaccine induces enhanced immunity against bubonic plague in mice and guinea pigs. Vaccine. 2006; 25:7620-8.Feodorova V.A., Pan'kina L.N., Savostina E.P., Sayapina L.V., Motin V.L., Dentovskaya S.V. et al. A Yersinia pestis lpxM-mutant live vaccine induces enhanced immunity against bubonic plague in mice and guinea pigs. Vaccine. 2006; 25:7620-8.Frey J. Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines. Vaccine. 2006; 25:5598-605.Frey J. Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines. Vaccine. 2006; 25:5598-605.Knirel Y.A., Lindner B., Vinogradov E.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Shaikhutdinova R.Z. et al. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis. Biochemistry. 2005; 44(5):1731-43.Knirel Y.A., Lindner B., Vinogradov E.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Shaikhutdinova R.Z. et al. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis. Biochemistry. 2005; 44(5):1731-43.Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982; 281 p.Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982; 281 p.Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics. 1972. 280 p.Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics. 1972. 280 p.Walsh C., Gangloff M., Monie T., Smyth T., Wei B., McKinley T.J. et al. Elucidation of the MD-2/TLR4 interface required for signaling by lipid IVa. J. Immunol. 2008; 181(2):1245-54.Walsh C., Gangloff M., Monie T., Smyth T., Wei B., McKinley T.J. et al. Elucidation of the MD-2/TLR4 interface required for signaling by lipid IVa. J. Immunol. 2008; 181(2):1245-54.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.